摘要：miRNA和siRNA都是由21-22个核苷酸组成的小RNA，它们可以引导Argonaute蛋白复合物靶向并结合到互补的mRNA 上，从而抑制其表达【1】。在哺乳动物中，miRNA通过核 Drosha-DGCR8复合物和细胞质Dicer的逐步切割产生，并最终与
撰文 | 格格
miRNA和siRNA都是由21-22个核苷酸组成的小RNA，它们可以引导Argonaute蛋白复合物靶向并结合到互补的mRNA 上，从而抑制其表达【1】。在哺乳动物中，miRNA通过核 Drosha-DGCR8复合物和细胞质Dicer的逐步切割产生，并最终与四种Argonaute效应蛋白 (Ago1-4) 结合。Argonaute 蛋白与适配蛋白GW182 （TNRC6） 协同作用，抑制与miRNA 5’ 端配对的靶标。过去二十年的研究主要集中在介导RNA沉默的正向作用因子上，例如Drosha、DGCR8和Dicer。然而，目前只有少数因子被发现可以抑制核心miRNA通路功能。
DGCR8是Microprocessor 复合物中的双链RNA结合 （dsRBD） 辅因子，它是一种血红素蛋白【2】。这意味着DGCR8需要血红素作为辅助因子才能发挥其功能。DGCR8 的N端Rhed结构域可以结合血红素。血红素与Rhed结构域的结合稳定了DGCR8-Drosha 二聚体，Drosha 是一种 RNase III 酶，负责切割 pri-miRNA【3-4】。血红素的存在增强了DGCR8和Drosha对pri-miRNA底物的特异性和活性。这意味着在没有血红素的情况下，Microprocessor复合物的功能会受到影响。尽管已经有一些体外实验研究了DGCR8与血红素结合的功能，但是细胞内血红素生物合成相关基因发生突变后对miRNA的影响尚未得到研究。
近日，来自美国纽约斯隆凯特琳研究所的Eric C. Lai研究团队在Science杂志发表题为Noncanonical role of ALAS1 as a heme-independent inhibitor of small RNA-mediated silencing的研究论文。5-氨基乙酰丙酸合酶1-ALAS1是血红素生物合成的起始酶。该研究揭示了ALAS1在细胞质发挥着非典型作用，尽管已知血红素是核 miRNA 加工的积极辅助因子，ALAS1作为一个血红素-非依赖性的miRNA抑制剂，通过抑制RISC组装和调节Ago2蛋白水平来降低 miRNA 水平。
研究人员首先在HEK293T细胞中构建了血红素合成途径中两个核心因子 （ALAS1和CPOX） 的基因敲除细胞系。实验结果显示，在血红素充足的情况下，ALAS1基因敲除细胞中的成熟 miRNA水平显著上升，而CPOX基因敲除细胞则没有出现这种变化。这表明ALAS1在miRNA生物合成中发挥着独立于血红素的重要作用。为了进一步验证ALAS1的作用，研究人员使用了一种pri-miRNA加工传感器，该传感器由一个带有pri-miRNA的萤火虫荧光素酶转录本组成。结果显示，ALAS1-KO细胞和CPOX-KO细胞在常规培养基中都没有表现出明显的差异。然而，当培养基中的血红素被去除后，两种基因敲除细胞系都表现出荧光素酶活性的增加，这表明血红素对Microprocessor复合物的功能有促进作用。
为了研究ALAS1对RISC组装的影响，研究人员使用体外RISC组装实验，并使用Pp-luc siRNA复合物作为底物。结果显示，ALAS1-KO细胞的细胞裂解物显著促进成熟RISC的形成，这表明ALAS1缺失可以促进RISC的组装。为了排除其他血红素生物合成因子的影响，研究人员还检测了CPOX-KO和ALAS1/CPOX双敲除 (ALAS1/CPOX-dKO) 细胞的RISC组装能力。结果显示，CPOX-KO细胞的RISC组装没有增加，而ALAS1/CPOX-dKO细胞的RISC组装与ALAS1-KO细胞相似。这进一步证明了ALAS1在抑制RISC组装中的特异性作用。
由于ALAS1主要在细胞质中发挥催化作用，研究人员推测细胞质中的ALAS1可能参与了 miRNA调控。实验结果显示，ALAS1缺失导致Ago2蛋白水平升高，而细胞质ALAS1前体蛋白可以抑制这种升高，并降低miRNA水平。为了进一步验证细胞质ALAS1的作用，研究人员构建了表达全长和截短ALAS1△N (缺乏线粒体定位信号) 的细胞系。结果显示，ALAS1△N可以抑制ALAS1-KO细胞中Ago2蛋白和miRNA的升高，表明细胞质ALAS1前体蛋白具有调节miRNA的功能。
为了研究ALAS1对miRNA沉默功能的影响，研究人员进行了Ago2 CLEAR-CLIP分析。结果显示，ALAS1-KO细胞中Ago2在miRNA靶位点上的占据增加，并且miRNA-Argonaute复合物对mRNA的沉默作用增强。为了验证ALAS1在小鼠中的功能，研究人员构建了Alas1条件性敲除小鼠模型。结果显示，Alas1敲除小鼠的肝细胞中成熟miRNA水平升高，并且 RNAi沉默功能增强。
细胞内血红素水平必须精确控制，因为它不仅是必需的辅因子，而且过量时也有毒性 。然而，ALAS1 反馈调节的机制可能产生不良后果，特别是在急性肝卟啉症 (AHPs) 中。这是遗传性疾病，由 ALAS1 下游特定血红素生物合成酶缺乏引起，其特征是急性神经内脏毒性。当肝脏 ALAS1 被诱导发作的因素 （例如，与月经相关的激素波动、CYP450 诱导药物等） 诱导时，血红素途径中的第三种酶，卟啉原脱氨酶 [(PBGD); 也称为羟甲基双吡咯合成酶 (HMBS)] ，可能成为限速步骤，导致中间体 δ-氨基乙酰丙酸 (ALA) 和卟啉原 (PBG) 积累。这些代谢物，特别是 ALA的神经毒性作用被认为是急性卟啉病发作的发病机制。因此，目前的治疗方法旨在抑制诱导肝脏 ALAS1 表达。血红素输注是治疗急性发作的标准方法，被认为可以提供外源性血红素以负反馈抑制肝脏 ALAS1。最近，靶向肝脏 ALAS1 的 RNAi 疗法在小鼠模型中证明有效，并有效预防人类患者的复发性发作。这些数据导致 ALAS1-siRNA 成为第二种获得FDA批准的RNAi 药物 (givosiran) 。
这项研究表明，ALAS1的消耗可能会增强RNAi介导的基因抑制。ALAS1在线粒体之外的非典型功能，作为RISC组装的抑制因子，从而抑制miRNA的积累。这项研究的发现为提高RNAi疗法的有效性提供了新的思路，并提示ALAS1抑制剂可能作为RNAi疗法的辅助剂。
10.1126/science.adp9388
制版人：十一
参考文献
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4. J. Quick-Cleveland et al.,Cell Rep. 7, 1994–2005 (2014).
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来源：老钱的科学课堂
