摘要：糖尿病周围神经病变（DPN）的发病因素复杂多样 ，主要有氧化应激 、细胞凋亡 、血管及代谢因素等 。线粒体在能量代谢及胰岛素分泌等过程中发挥重要作用 ，作为活性氧的主要来源以及凋亡的主要途径 ，线粒体亦参与了糖尿病及糖尿病并发症的发生［１］ 。线粒体的融合和分
糖尿病周围神经病变（DPN）的发病因素复杂多样 ，主要有氧化应激 、细胞凋亡 、血管及代谢因素等 。线粒体在能量代谢及胰岛素分泌等过程中发挥重要作用 ，作为活性氧的主要来源以及凋亡的主要途径 ，线粒体亦参与了糖尿病及糖尿病并发症的发生［１］ 。线粒体的融合和分裂是细胞内的基本事件 ，两者同时发生 ，保持一定的动态平衡 ，这种平衡对维持正常的线粒体形态和功能十分重要 ，当线粒体分裂相关蛋白（Drp ‐１）超表达后 ，线粒体持续分裂 ，失去动态平衡 ，引起相关凋亡因子表达水平的改变 ，诱导细胞凋亡 。 近年来不断有国内外学者对线粒体动力学与
糖尿病及糖尿病多种并发症的关系进行研究 。 已有研究［２］证实 ，Drp‐１ 影响线粒体形态 、功能和细胞凋亡 ，与神经系统变性疾病的发病密切相关 。 本研究通过观察 Drp‐１ 、Bax 、Bcl‐２ 与 DPN 的关系 ，和木丹颗粒及木丹颗粒联合 α‐硫辛酸对 Drp‐１ 、Bax 、Bcl‐２的影响 ，探讨木丹颗粒及木丹颗粒联合 α‐硫辛酸治疗 DPN 的有效性及其机制 。
材料与方法
一 、实验材料
SPF 级健康雄性大鼠 ５０ 只 ，体重（２００ ± ２０） g ，河南省实验动物中心提供 ，随机分为正常对照（NC）
组 ，糖尿病 （DM ）组 、木丹颗粒 （MD）组 、α‐硫辛酸（LA）组和木丹颗粒联合 α‐硫辛酸（CT ）组 ，每组各１０ 只 。 STZ（美国 Sigma 公司） ，α‐硫辛酸（美国 Sig‐ma 公司） ，RNA 提取试剂 、反转录试剂盒 、PCR 引物及内参基因引物（上海 GENERAY 公司） ，总超氧化物歧 化 酶 （T‐SOD ） 、谷 胱 甘 肽 （GSH ） 、丙 二 醛
（MDA） 、过氧化氢酶（CAT ）试剂盒（南京建成生物公司） ，木丹颗粒（辽宁奥达制药有限公司） 。
二 、实验方法
１畅 动物模型建立及分组 ：适应性喂养 １ 周 ，单次腹腔 STZ ６０ mg ／kg ，７２ h 后抽取尾静脉血测定血糖 ，大于 １６畅７ mmol／L 者为造模成功 。 将成模大鼠随机分为 DM 组 、MD 组 、LA 组和 CT 组 。 DM 组予生理盐水 １０ ml／（kg · d）灌胃 ，MD 组用温开水溶解木丹颗粒 ２畅３ g ／（kg · d） ，１０ ml／（kg · d）灌胃 ，LA组予 α‐硫辛酸 ２０ mg ／（kg · d） ，１０ ml／（kg · d）灌胃 ，CT 组予木丹颗粒 ２畅３ g ／（kg · d）及硫辛酸 ２０mg ／（kg · d） ，１０ ml／（kg · d）灌胃 。 自由饮食饮水饲养 １２ 周 ，观察一般情况 ，包括精神状态 、毛色 、摄食 、饮水量及日常活动 ，每 ４ 周测血糖 １ 次 。２畅 检测指标 ：治疗结束后将大鼠麻醉并测量坐骨神经传导速度（sNCV） 。 分光光度法检测血清 T‐SOD 、MDA 、GSH 、CAT 水平 。 取坐骨神经组织 ，在液氮下研磨 ，用 Trizol 试剂提取总 RNA ，并进行反转录制备 cDNA ，应用 SYBR Green Ⅰ 荧光染料法进行 RT‐PCR 反应 ，获取 Ct 值 ，采用 ２ － Δ ΔCt法计算相对表达量 。
三 、统计学方法
采用 SPSS １７畅０ 软件进行统计学分析 。 计量资料以 珚x ± s 表示 ，多组间比较采用单因素方差分析 ，组间两两比较采用 L SD‐t 检验 。
结 果
一 、各组一般情况
实验期间观察 ，NC 组精神状态良好 、毛色光亮 、体重渐长 、摄食饮水及活动均正常 ，垫料干 。 DM 组出现多饮 、多食 、多尿症状 、蜷卧拱背 、毛发稀疏 、发黄无光泽 、皮肤溃烂 、活动减少 、垫料湿 ，体质量增长缓慢甚至降低 ，眼球呈白内障改变 。 MD 、LA 、CT 组也出现上述症状 ，较 DM 组轻 。 因血糖过高 、一般状态差 ，实验过程中死亡 ４ 只 ，DM 组 ２ 只 ，MD 组 、LA组各 １ 只 。
二 、各组血糖及坐骨神经传导速度的变化
DM 组 FPG 水平高于 NC 组（P ＜ ０畅０５ ） ，MD 、LA 、CT 组与 DM 组比较 ，差异无统计学意义（P ＞０畅０５） ；DM 组 sNCV 低于 NC 组 ，MD 、LA 及 CT 组sNCV 高于 DM 组 ，CT 组升高更显著（P ＜ ０畅０５ ） 。（表 １）
三 、各组 T‐SOD 、MDA 、CAT 及 GSH 水平
与 NC 组比较 ，DM 组 T‐SOD 、GSH 、CAT 活性下降 ，MDA 水平升高（ P ＜ ０畅０５ ） ；与 DM 组比较 ，MD 、LA 及 CT 组 T‐SOD 、GSH 、CAT 活性上升 ，MDA 水平下降（P ＜ ０畅０５ ） ，CT 组氧化应激改变更显著（P＜ ０畅０５） ，MD 与 LA 组比较 ，差异无统计学意义（P＞ ０畅０５） 。 （表 ２）
四 、坐骨神经 Drp‐１ 、Bax 、Bcl‐２mRNA 的相对表达量
采用 ２ － Δ ΔCt法计算各组相对表达量 。 与 NC 组比较 ，DM 组 Drp ‐１ 、Bax 表达水平增加 ，Bcl‐２ 表达减少（P ＜ ０畅０５） ；与 DM 组比较 ，MD 、LA 及 CT 组
Drp‐１ 、Bax 表达减少（P＜ ０畅０５） ，Bcl‐２ 表达增加 ，其中 CT 组尤为显著 ，MD 与 LA 组比较 ，差异无统计学意义（P＞ ０畅０５） 。 （表 ３）
讨 论
DPN 的发病机制较为复杂 ，AGEs 形成 、多元醇代谢 、氧化应激 、细胞凋亡和神经营养缺乏等参与其中 。 除上述机制外 ，目前认为线粒体亦参与了糖尿病及并发症的发生 ，线粒体功能障碍引起的细胞凋亡也可能是糖尿病神经病变的发病机制之一［３ ］ 。线粒体动力学失衡被认为是糖尿病发生的重要原因 ，而线粒体功能障碍及线粒体相关的氧化应激是
引起糖尿病神经病变的病理学核心机制［４ ］ 。 线粒体是一个动态流动的细胞器 ，当线粒体受损时 ，可通过融合分裂动力学调控正常细胞内线粒体质量 ；当线粒体融合和分裂失衡时引起线粒体形态学的变化 。过度分裂会导致线粒体碎裂 ，过度融合则引起线粒
体小管伸长［５］ 。Drp‐１ 是重要的线粒体分裂调控蛋白 ，其活性改变调控着线粒体的形态功能变化 。 Drp‐１ 主要定位于细胞浆 ，并以多聚体 （可能是四聚体）的形式存在［６］ 。 下调 Drp‐１ 表达可抑制线粒体断裂 ；上调Drp‐１ 表达可促进线粒体的断裂的发生 ，并导致自由基产生的明显增加 。 研究［７ ］发现 ，高糖可诱导背根神经节细胞 Drp‐１ 的表达 ，增强线粒体的分裂加重细胞损伤 。 Bax 与 Bcl‐２ 是调控细胞凋亡的重要基因 。 细胞凋亡时 ，活化的 Bax 激活一种泛素样修饰的小分子蛋白 ，能结合 Drp‐１ ，从而募集大量胞质内的 Drp‐１ 聚集于线粒体膜上的分裂位点 ，并参与凋亡相关的线粒体分裂活动 。 而 Bcl‐２ 可以与 Bax结合形成异源二聚体能抑制细胞凋亡 ，二者相互拮抗［８］ 。 随着对线粒体功能障碍的深入研究发现 ，三者与糖尿病神经病变密切相关 ，是反应糖尿病神经病变的重要指标 。 本研究中 DM 组与 NC 组比较 ，
Drp‐１mRNA 、Bax mRNA 相对表达量升高 ，而 Bcl‐２mRNA 相对表达量下降可说明上述观点 。木丹颗粒由黄芪 、延胡索 、三七 、赤芍 、丹参等九味中药组成 ，具有益气行滞 、活血祛瘀 、通络止痛的功能 ，有研究发现 ，该药有影响神经代谢物质水平 、提高神经传导速度 、修复受损神经 、改善血液微循环等综合作用 ，对糖尿病大鼠及糖尿病患者病情的改善具有明显的积极意义 。 与 DM 组比较 ，MD 组坐骨神经中 Drp‐１ 、Bax 表达和 MDA 含量下降 ，Bcl‐２及 T‐SOD 、GSH 、CAT 活力升高 ，进一步说明了木
丹颗粒的神经保护作用 ，本研究同样设立了 LA 、CT组 ，临床上已普遍使用具有抗氧化作用的药物 α‐硫辛酸治疗 DPN ，并取得了良好的疗效［９ ］ 。 LA 组与MD 组各指标比较 ，差异无统计学意义 ，但是 CT 组改变更加明显 ，说明木丹颗粒治疗 DPN 的效果不亚于 α‐硫辛酸 ，两者联合治疗效果更佳 。
综上所述 ，氧化应激和细胞凋亡在 DPN 中起到了重要作用 ，并且相互联系 。 本研究通过建立糖尿病大鼠模型 ，并以神经电生理指标为依据判断是否发生神经病变 ，发现糖尿病大鼠坐骨神经 Drp‐１ 、Bax mRNA 的表达升高 ，Bcl‐２mRNA 降低 ，该结果与血清中氧化应激标记物的变化相伴随 ，证实 Bax表达上调 ，Bcl‐２ 表达下调引起的细胞凋亡可能由Drp‐１ 高表达引起的线粒体氧化应激实现的 。 Drp‐１ 是预防和治疗糖尿病及其多种并发症的潜在新靶点 。 而木丹颗粒能干预 Drp‐１ 表达 ，减少细胞凋亡及氧化应激水平 ，对坐骨神经起保护作用 ，对早期糖尿病患者的临床防治及 DPN 的治疗有一定的指导意义 。
来源：聚智健识
