摘要：视网膜，是我们感知光线的窗户，而遗传性视网膜疾病却可能让这扇窗户变得模糊不清。幸运的是，爱尔眼科唐仕波教授、陈建苏教授及其团队研究发现：借助先进的基因增强疗法，科学家们已成功攻克了一种导致视网膜发育迟缓的遗传性疾病。现在，让我们共同探索这一突破性研究，如何为遗
视网膜，是我们感知光线的窗户，而遗传性视网膜疾病却可能让这扇窗户变得模糊不清。幸运的是，爱尔眼科唐仕波教授、陈建苏教授及其团队研究发现：借助先进的基因增强疗法，科学家们已成功攻克了一种导致视网膜发育迟缓的遗传性疾病。现在，让我们共同探索这一突破性研究，如何为遗传性视网膜疾病患者点亮新的希望之光！
文章介绍
题目：X连锁视网膜裂孔RS1（E72K）突变的视网膜类器官表现出感光器发育延迟，并通过基因增强疗法得到挽救
杂志：Stem Cell Research & Therapy
影响因子：IF=7.5
发表时间：2024年5月
#1
研究背景
Background
X连锁视网膜劈裂症（XLRS）是一种X连锁遗传的玻璃体视网膜疾病，其主要特征涵盖中心视力丧失、黄斑囊性裂解、神经视网膜层分裂以及电视网膜图（b-wave）振幅降低。尽管对RS1相关视网膜退化的机制已有一定了解，但尚未完全明晰。过去，研究者们已经构建了多个小鼠模型来探索XLRS的病理机制，然而这些模型都存在一定的局限性，尤其是由于小鼠视网膜与人类视网膜在结构上的差异，使得这些模型可能并不完全适用于XLRS的研究。
鉴于现有治疗手段对XLRS患者视力的改善效果有限，研究人员希望通过使用hiPSC衍生的视网膜类器官（RO）来深入探究XLRS的疾病机制，并寻求基因增强疗法的可能性。这种方法有望更精确地模拟人类XLRS的病理过程，为开发更为有效的治疗方法奠定坚实的基础。
#2
研究思路
Methods
从两名RS1突变（E72K）XLRS患者的外周血单核细胞中重编程hiPSC，并将其分化为RO。
通过转染特定质粒在HEK293T细胞中过表达RS1蛋白，并进行Western blotting分析蛋白表达。
进行RNA提取和定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析基因表达水平。
进行AAV生产和处理以增强RO中的RS1基因。
使用Microelectrode Array（MEA）记录RO中的动作电位。
进行透射电子显微镜（TEM）观察RO样本。
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
#3
研究结果
Results
1. 来自XLRS患者的hiPSC的产生和表征
本研究将两名患有X连锁视网膜裂（XLRS）的患者（患者-1和患者-2）及两名健康对照（对照-1和对照-2）纳入研究。通过细胞重编程技术，患者-1、患者-2和对照-1的外周血单核细胞（PBMC）被转化为人类诱导多能干细胞（hiPSC）细胞系，而对照-2的hiPSCs来自Nuwacell Biotechnology。扫描激光眼底镜（SLO）和光学相干断层扫描（OCT）检测发现，XLRS患者视网膜出现典型的黄斑分裂，而对照-1则呈现正常眼底特征和OCT形态。此外，来自患者和对照的hiPSC细胞系均表现出典型的干细胞特征和多能干细胞标记物的表达，并具备多谱系分化潜力。此外，所有hiPSC系的核型均正常（图1）。
图1
2. hiPSC 衍生的层状 RO 模拟人类视网膜
研究人员利用患者-1、患者-2、对照-1和对照-2获得的hipsc进行了RO构建。在发育早期，这些RO表现出视网膜发育相关的关键转录因子和标记物的表达。随着时间的推移，RO进一步分化，表达神经细胞和无分泌细胞的标记物，并在长期培养后，在第260天显示出带状突触蛋白与突触后蛋白的共存。倒置显微镜下观察，RO展现出类似人类视网膜的层状结构，包括内核层、外网状层、外核层以及光感受器的内段和外段。此外，透射电子显微镜（TEM）证实了RO顶端刷状结构的超微结构，表明光感受器外段的形成。这些结果共同表明，通过此方法生成的RO能够模拟人类视网膜，为XLRS的体外疾病模型提供了合适的平台（图2）。
图2
3. 突变体RS1 (E72K)导致RS1蛋白缺陷
在HEK293T细胞中过表达野生型（WT）和RS1 (E72K)突变蛋白后，实验发现RS1 (E72K)突变在细胞内以单体形式存在，与野生型相似，但在细胞培养基上清液中未检测到该突变蛋白，提示其分泌受损。非还原条件下的WB分析显示，与野生型RS1形成的八聚体不同，RS1 (E72K)突变未能形成八聚体。此外，通过共聚焦荧光显微镜观察，RS1 (E72K)突变与内质网和高尔基复合体的标记物共定位，说明该突变蛋白能到达分泌途径的这两个关键部位。然而，在RO冷冻切片中，患者来源的样本中RS1的表达显著低于对照样本，进一步证实了RS1突变导致RS1蛋白的分泌和八聚体形成功能受损（图3）。
图3
4. RS1（E72K）突变 RO 中感光细胞发育延迟
实验显示，RO最大长度的生长持续至第10周，表明其尚未完全成熟。在对照和患者iPSC衍生的RO中，Ki67表达随时间减少，表明增殖逐渐停止并向成熟转变。第260天的分析显示，两组RO在神经胶质细胞和杆双极/ON双极细胞分类上没有显著差异，但患者组RO在rhodopsin（Rho）和M/L Opsin的表达上显著降低。研究进一步揭示了RS1 (E72K)突变导致光感受器成熟延迟，特别是在Rho亚型中。这种延迟与光感受器成熟前NRL和RCVRN表达的减少有关，但与细胞凋亡无关（图4）。
图4
5. RS1 (E72K)突变RO的自发活性改变
研究人员通过使用高密度MEA评估了对照组和患者来源iPSC衍生的RO自发活性。在第8周将活性氧置于芯片上，并于第12周分析数据。通过栅格和网络活动图记录120秒内的尖峰活动，发现对照组和患者组ipsc衍生RO均显示出自发的节律性爆发活动。进一步分析显示，患者1 iPSC衍生RO在脉冲内的峰值率和每次爆发的峰值均显著高于对照组1。此外，患者1的iPSC衍生RO的突发峰值放电率也更高。这些结果表明，RS1 (E72K)突变的RO在不成熟阶段显示出增强的自发活性，这可能反映了RGC活性的异常变化（图5）。
图5
6. RO中RS1 (E72K)突变相关基因表达变化
研究人员在第90天对对照-1和患者-1 iPSC衍生的RO进行了RNA测序，以研究两者间的转录组差异。主成分分析和Pearson相关系数显示，对照-1和患者-1的样本具有高度的生物可重复性。活火山图显示，在患者-1中，有163个基因上调，260个基因下调。进一步分析发现，下调的基因主要涉及化学突触传递、突触后膜电位调节、前后模式规范以及神经系统发育等生物过程，并且与A/1类（视紫红质样受体）相关基因显著下调。KEGG通路分析显示与光感受器和突触功能相关的通路中DEG显著富集。这些发现表明，RS1突变RO中光感受器和突触相关基因的早期下调可能影响感光器的发育（图6）。
图6
7. AAV2.7m8介导的RS1补充修复的RS1(E72K)突变体ROs中感光细胞发育延迟
为了探究RS1对RO中光感受器发育的影响，研究人员在第70天（光感受器成熟前）将携带RS1基因的AAV2.7m8和用于追踪的AAV2.7m8-mCherry病毒分别转导到患者-1的iPSC衍生的RO中。结果显示，mCherry荧光主要在患者源性AAV2.7m8-mCherry RO的外核层被检测到，并且从第90天到第120天，mCherry的表达逐渐增加，转导效率也随之提高。同时，通过免疫荧光染色发现，RS1在患者AAV2.7m8-RS1 RO中广泛分布并高表达，说明RS1基因成功转导并表达。
进一步的研究表明，AAV2.7m8介导的RS1基因增强促进了RO中光受体相关标志物的表达，如NRL和Rho。特别是在第90天和第120天，与AAV2.7m8-mCherry RO相比，患者AAV2.7m8-RS1 RO中NRL和Rho的表达均显著增加，且杆状光感受器的形态与对照RO相似。这些结果表明，RS1基因的增强治疗部分恢复了RO中延迟的光感受器发育，并可能使其结构正常化（图7）。
图7
小结
本研究为使用基因增强疗法挽救视网膜类器官感光器发育延迟提供了重要见解。研究发现，RS1基因在视网膜发育早期起着关键作用，而RS1 (E72K)突变导致的发育延迟可以通过基因增强疗法得到纠正。此外，研究结果强调了RS1不仅仅是维持视网膜结构的粘附蛋白，还在感光细胞的发育和突触形成中扮演着重要角色。通过对XLRS患者衍生的视网膜类器官模型进行分析，研究团队展示了基因治疗对XLRS疗法时机选择的重要性。这些发现为我们深入了解RS1 (E72K)突变在视网膜中的作用提供了新的线索，为遗传性视网膜疾病的治疗提供了有力支持。这些发现不仅拓展了我们对基因治疗在眼科领域的应用认识，也为未来研究和临床实践提供了有益的指导。
参考文献
Duan C, Ding C, Sun X, Mao S, Liang Y, Liu X, Ding X, Chen J, Tang S. Retinal organoids with X-linked retinoschisis RS1 (E72K) mutation exhibit a photoreceptor developmental delay and are rescued by gene augmentation therapy. Stem Cell Res Ther. 2024 May 31;15(1):152. doi: 10.1186/s13287-024-03767-4. PMID: 38816767; PMCID: PMC11140964.
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来源：培养盒守护者
