摘要：在生物制药行业，双抗(BsAbs)的开发和生产正逐渐成为研究的热点。然而双抗的纯化过程复杂，常常伴随高水平的杂质和低产率。因此，优化纯化过程以提高产率和纯度对于其临床应用至关重要。实验流程详情可以去默克的官网搜索查看www.sigmaaldrich.cn。
在生物制药行业，双抗(BsAbs)的开发和生产正逐渐成为研究的热点。然而双抗的纯化过程复杂，常常伴随高水平的杂质和低产率。因此，优化纯化过程以提高产率和纯度对于其临床应用至关重要。实验流程详情可以去默克的官网搜索查看www.sigmaaldrich.cn。
复合模式填料(Mixed-Mode Resins)作为一种新兴的纯化技术，结合了离子交换和疏水性双重作用机制，已被广泛应用于双抗的纯化过程。本文将解读一项研究，重点分析复合模式填料在双特异性抗体纯化过程中的实验设计，优化策略和结果。
实验设计
实验评估的分子为不对称性双抗，等电点为6.84（根据蛋白质序列计算），平均疏水系数为logP 0.397，样品经亲和层析纯化，目标蛋白含量为91.6% ，杂质主要包括聚集体 (8.2%) 和片段(0.2%)。研究中使用了四种不同的混合模式阳离子填料：Capto MMC、MX-Trp-650 M、Nuvia cPrime和Eshmuno CMX。通过DoE方法，结合HTS（高通量筛选）技术，对四种填料的最优上样条件进行了确定。实验设计基于统计模型，分析了上样和洗脱条件（如pH值和NaCl浓度）对分析响应（包括结合能力、HCP含量和纯度）的影响。
初步筛选实验
研究团队首先进行了初步筛选，确定了不同pH值（4.0至8.0）和NaCl浓度（0至800 mM）条件下蛋白的结合能力，以评估复合模式填料对目标蛋白的捕获能力。图1实验结果显示：
Capto MMC：对于本次研究的双抗分子显示出较强的结合，结合力对pH和NaCl浓度变化不敏感，对后续洗脱步骤优化造成一定的挑战。
MX-Trp-650M：显示出较强的耐盐性，适合在pH梯度条件下进行洗脱。
Nuvia cPrime：对盐浓度的变化较为敏感，适合高pH及进一步盐浓度的优化洗脱。
Eshmuno CMX：在低盐浓度（0-100 mM NaCl）条件下，随着pH值的升高，对蛋白的结合能力略有增强。推测Eshmuno CMX填料侧链配基的长触手设计，提供了更强的填料与蛋白之间的相互作用，使其在相同盐浓度下的结合能力超过了MX-Trp650 M和Nuvia cPrime。
图1. 四种填料的结合能力等高线图. a) Eshmuno CMX; b) Capto MMC ; c) MX-Trp-650M ; d) Nuvia cPrime
提高洗脱效率的两个关键策略是调节pH和盐浓度。根据之前结合能力的研究结果，选择 pH4.0-8.0 和200-800 mM 的 NaCl 浓度用于Eshmuno CMX 和 Nuvia cPrime 的洗脱筛选。对于 MX-Trp-650 M，洗脱筛选的 pH 范围为 4.0–8.0，NaCl 浓度范围为 100 至 500 mM。
图2-a和图2-b结果显示，MX-Trp-650 M在pH6.5-8.0范围内，采用200mM以上的盐浓度洗脱时，收率可维持在90%以上，但纯度偏低。pH
图2-c和图2-d结果显示，Nuvia cPrime在pH6.5-8.0范围内，采用400mM以上盐浓度洗脱时，收率可达90%以上，但同样纯度偏低。pH
图2. MX-Trp-650 M和Nuvia cPrime洗脱条件优化的产率和纯度等高线图。a) MX-Trp-650 M 的收率；b) MX-Trp-650 M 的 SEC-HPLC 结果；c)Nuvia cPrime 的收率；d) Nuvia cPrime 的 SEC-HPLC 结果。
图3结果显示，Eshmuno CMX在纯化过程中， 洗脱蛋白的纯度受到 pH和 NaCl 浓度变化的影响。采用pH6.5，增加盐浓度的洗脱条件下，收率提升，但纯度降低。在pH5.5-6.5的范围内进行洗脱优化，有利于获得高收率和高纯度的目标蛋白。
图3. Eshmuno CMX洗脱条件优化的优化的响应因子等高线图. a) Eshmuno CMX 的收率；b) Eshmuno CMX 的 SEC-HPLC 结果；c) Eshmuno CMX 的 NR CE-SDS 结果；d) Eshmuno CMX 的 HCP 结果。
层析柱验证
根据洗脱优化实验期间观察到的收率和纯度趋势，在层析柱上进行层析条件验证，柱运行的床高为 15.5 cm，直径为 0.66 cm。保留时间为5分钟，动态结合载量为30g/L。Eshmuno CMX的盐梯度洗脱方法能够以99%的纯度和80%的收率分离目标蛋白，效果优于Nuvia cPrime和MX-Trp-650 M。在此基础上，将Eshmuno CMX的线性梯度洗脱转换为等度洗脱条件（图4），洗涤步骤1使用高 pH 值和低盐浓度的缓冲溶液来消除上样后的杂质。随后的洗涤 步骤2，采用低 pH 值和 150mM 盐浓度缓冲液，旨在去除聚集杂质。随后，通过300mM浓度的NaCl等度洗脱回收目标蛋白。
图4. EshmunoCMX等度洗脱层析条件
对收集到的蛋白质通过 SEC-HPLC 分析，最终有效组分的纯度为 99.0%，收率为77%，Eshmuno CMX实现了杂质和目标分子的高效分离与回收（图5）。图5. Eshmuno CMX等度洗脱层析结果总结
Eshmuno CMX 复合阳离子填料
Eshmuno CMX是默克Eshmuno 高性能家族的成员，具有创新的表面触手结构（图6），将弱阳离子交换性能与中等疏水基团结合在一起，提高对于目标物质捕获的选择性。在结合和洗脱模式下具有适中的亲和力，可有效分离低分子量、高分子量和细胞宿主蛋白等杂质。图6. Eshmuno CMX 层析填料创新触手结构
总结
该研究通过DoE和HTS技术的结合，为四种混合模式阳离子填料的操作参数提供了深入的理解，为双抗的工业规模纯化提供了实用的优化策略。通过调整盐浓度和pH值，确定了Eshmuno CMX最佳的上样和洗脱条件。这些优化条件使得目标蛋白的收率和纯度都得到了显著提升，从而证实了Eshmuno CMX在双抗的层析纯化过程中展现出了优异的分离效果和高选择性。
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来源：不能胖胖胖
