摘要：影像学上，肺腺癌（LUAD）中的磨玻璃结节（GGN）和部分实性结节（PSN）在临床表现、生物学特性和预后方面存在显著异质性。最近的一项研究中，成都中医药大学附属医院由凤鸣教授团队对LUAD不同影像学表型的异质性及影响肿瘤演变的相关因素进行探讨，通过调节CXCL
影像学上，肺腺癌（LUAD）中的磨玻璃结节（GGN）和部分实性结节（PSN）在临床表现、生物学特性和预后方面存在显著异质性。最近的一项研究中，成都中医药大学附属医院由凤鸣教授团队对LUAD不同影像学表型的异质性及影响肿瘤演变的相关因素进行探讨，通过调节CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的相对比例和功能状态，为维持TME内的动态平衡和提高免疫治疗效果提供了潜在的治疗策略。
文章介绍
题目：单细胞RNA测序揭示肺腺癌磨玻璃结节和部分实性结节侵袭和转移过程中的免疫微环境生态位转换
杂志：Molecular cancer
影响因子：27.7
发表时间：2024年11月
#1
研究背景
Background
随着高分辨率低剂量计算机断层扫描的广泛使用，以肺结节形式检测到的LUAD病例越来越多，其中GGN和PSN是两种最常见的类型。具有GGN特征的早期LUAD术后5年无病生存率接近100%，而具有更多实性成分的PSN显示出更高的转移和疾病进展风险。目前还没有全面的研究评估GGN和PSN特征对微浸润腺癌（MIA）、浸润性腺癌（IAC）和转移性肺癌（MLC-LUAD的分子和免疫学特征的影响。为了描绘GGN和PSN-LUAD的进化轨迹，研究人员为GGN和PSN-LUAD生成了肿瘤组织和正常肺组织在疾病进展各个阶段（MIA/IAC/MLC）的单细胞转录组图谱。这些图谱捕获了LUAD侵袭和转移过程中TME细胞群的异质性，具有不同的放射学特征。利用公开可用的患者测序数据和多重免疫荧光技术，研究人员进一步确定了TME细胞的分布模式。在这种广泛的异质性中，研究人员确定了驱动肿瘤抑制或促进表型的关键TAM亚群-TREM2+TAMs和CXCL9+TAM，并使用类器官和基因编辑技术阐明了调节其分化的潜在机制。总之，该研究提供了GGN和PSN-LUAD进化轨迹的分子特征的深入表征，具有重要的临床意义。
#2
研究思路
Methods
研究人员揭示了GGN-和PSN-LUAD的不同TME模式，并确定CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs是影响两种影像学表型之间侵袭和转移生态学差异的关键TME亚群。进一步描绘了一个由CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs组成的促肿瘤或抗肿瘤变量的高度协调网络，探索了它们的潜在来源，与T细胞和肿瘤细胞的相互作用，以及相关调节基因在不同放射学亚型LUAD中的表达模式。该研究为LUAD的异质性提供了新的生物学见解，其影像学特征的多样性可能会影响临床LUAD研究的精准医学进展。
#3
研究结果
Results
1. GGN-和PSN-LUAD的单细胞形态
研究人员收集成都中医药大学附属医院胸外科和四川省肿瘤医院19例未经治疗的LUAD患者新鲜手术切除的肺组织标本，包括4例癌旁正常肺组织标本；GGN-MIA、GGN-IAC和GGN-MLC样本各3份；3份PSN-MIA、3份PSN-IAC和1份PSN-MLC样本。将样品消化成单细胞悬液后进行ScRNA-seq技术检测，过滤后共获得188594个细胞，分为12个簇，并使用经典标记基因表达进行注释，包括T细胞、上皮细胞、B细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突细胞、成纤维细胞、肥大细胞、中性粒细胞、浆细胞、淋巴内皮细胞和平滑肌细胞。随后，对异质性进行分析发现，PSN-LUAD组和GGN-LUAD组T、B淋巴细胞富集，髓系细胞浸润减少。此外，随着GGN-LUAD和PSN-LUAD的侵袭和转移发生变化，肿瘤内细胞的组成在组织特异性常住人群中表现出差异（图1）。结果表明，不同肿瘤组织阶段细胞组成的差异可能与疾病进展机制相关。
图1 LUAD伴GGN和PSN的影像学特征表现为肿瘤和癌旁组织内的细胞景观
2. PSN-和GGN-LUAD侵袭转移过程中上皮细胞和内皮细胞的表达模式
为了准确区分TME中的肿瘤细胞和正常上皮细胞，研究人员对31498个上皮细胞进行了降维和聚类分析。通过整合来自拷贝数变异（inferCNV）、CopyKat和谱系特异性基因表达的信息，成功地区分了恶性上皮细胞和非恶性正常上皮细胞。对非恶性正常细胞的分析确定了上皮细胞亚群，包括AT1、AT2、基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞和杯状细胞。进一步研究上皮细胞的异质性。采用Cytotrace、cellcyclesing、AddModuleScore等方法评估恶性肿瘤细胞的特征。Cytotrace评分结果表明肿瘤细胞群表现出更强的谱系分化能力，AddModuleScore结果表明肿瘤细胞表现出更高的EMT特征。
此外，研究人员观察到PSN-LUAD组不同阶段的Cytotrace评分和EMT评分普遍高于GGN-LUAD组，表明两组的恶性程度不同。Ki-67在除G0期外的所有细胞周期中均有表达，Ki-67高表达是恶性程度较高的标志。染色结果显示，随着疾病从MIA进展到IAC期，Ki-67表达显著增加，MLC期的Ki-67染色强度进一步显著增加。此外，在生存分析中，编码Ki-67的基因MKI67与预后显著相关。这些数据突出了GGN-和PSN-LUAD不同进展阶段上皮细胞的转录程序异质性，这可能与临床疾病进展相关。内皮细胞是构成淋巴管的重要细胞类型，可影响肿瘤微环境的营养输送和氧供。检测结果显示，GGN-和PSN-LUAD在TME中均表现出明显的内皮细胞比例降低，PSN-LUAD表现出更低的内皮细胞比例。为了进一步观察内皮细胞不同亚型的变化趋势，研究人员将内皮细胞亚成簇，并将其注释为六种细胞类型：动脉细胞、毛细血管细胞、毛细血管_aerocyte细胞、Tip细胞、静脉细胞和淋巴细胞。Velocity分析显示Tip细胞定位于Vein内皮细胞和Capillary内皮细胞之间的发育分化轨迹，Cytotrace结果表明Tip细胞具有更强的分化能力。此外，与GGN-LUAD样本相比，在PSN-LUAD样本中观察到更高比例的Tip细胞，这可能是临床观察到的PSN-LUAD更快的侵袭和转移的潜在机制之一（图2）。
图2 上皮细胞和内皮细胞在GGN- PSN-LUAD侵袭转移过程中的表达模式
3. 对髓系细胞的详细分析揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs驱动的免疫微环境生态位转变
为了确定对肿瘤发展至关重要的髓系细胞，研究人员探索了重要细胞亚群的功能。发现巨噬细胞构成了一个主要的髓系细胞簇，并发挥了主要作用。RNA速度显示，除RTM+TAMs外，其他TAMs均起源于经典单核细胞，这为研究巨噬细胞分化轨迹提供了理论方向。M1和M2评分显示，CXCL9+TAMs的M1评分和TREM2+TAMs的M2评分在巨噬细胞亚群中最高。进一步分析发现，TREM2+和CXCL9+TAMs之间存在潜在的拮抗关系。Monocle2分析发现，在GGN-和PSN-LUAD的不同阶段，CXCL9+TAMs的轨迹树表现出一致的分化，表明CXCL9+TAMs在LUAD进展的不同阶段表现出相同的功能。在单核细胞向CXCL9+TAMs分化过程中，CXCLs显著上调，其中CXCL9的上调最为显著。此外，CXCL9+TAMs分化相关基因与免疫调节高度相关。拟时序分析揭示了TREM2+TAMs中的细胞分化异质性，突显出在状态4和7时，TREM2+TAMs中的SPP1基因表达水平升高。不同LUAD疾病阶段的细胞水平变化定量结果显示，在LUAD MIA-IAC阶段，TREM2+TAMs倾向于表现SPP1-特征，而在LUAD-MLC阶段，SPP1+TAMs的比例出现上升。PSN-MLC中SPP1+TAMs的比例显著高于GGN-MLC。此外，研究人员观察到TREM2+/SPP1-TAMs中VEGFA基因显著上调。在肺腺癌浸润的晚期，TREM2+TAMs主要表现为SPP1+的特征。同时，差异基因分析显示，在TREM2+/SPP1+TAMs中，SPP1、CSTB、GPNMB、CD9和MPP9等基因表达上调。多重免疫荧光结果显示肿瘤组织中存在TREM2+/SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs。这些标记基因的表达模式支持对TREM2+TAMs分化通路的推测，并进一步验证了拟时序轨迹分析的准确性（图3）。这些结果表明CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs的改变对LUAD的演变和进展有显著影响，并可能解释PSN-LUAD和GGN-LUAD之间不同的发展趋势。
图3 髓系细胞的详细分析
4. 免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN -和PSN-LUAD进展和转移中的作用
通过比较NC、GGN-MIA、GGN-IAC、GGN-MLC、PSN-MIA、PSN-IAC和PSN-MLC中T细胞比例的变化，揭示T细胞在GGN-LUAD和PSN-MLC侵袭和转移过程中的TME浸润。研究发现，与NC组相比，GGN-MIA、GGN-IAC、PSN-MIA组T细胞比例明显升高。此后，研究人员根据经典谱系标志物的表达确定了12个T细胞亚群，观察到CD8+Trm细胞比例在GGN-LUAD和PSN-LUAD中持续增加，且在GGN-MLC阶段的比例高于PSN-MLC阶段。研究人员还关注了另一种淋巴细胞谱系细胞类型-B细胞。B细胞被细分为三个簇：初始B细胞、记忆B细胞和浆细胞，对三种B细胞亚型的比例进行分析发现不存在不同组间表型比例的显著差异，说明B细胞主导的免疫微环境的变化与组织中B细胞的总体浸润丰度有关。利用CellChat，研究人员深入分析了T细胞、B细胞和巨噬细胞亚群在PSN-LUAD和GGN-LUAD进展和转移中的关键作用。发现在GGN-MIA和GGN-IAC阶段，与CXCL信号通路相关的细胞间相互作用显著增强，这一现象也在PSN-LUAD的MIA-IAC阶段得到验证。此外，研究人员观察到在MLC阶段，CXCL通路在GGN-MLC和PSN-MLC组中活性降低。然而，SPP1通路活性在PSN-MLC阶段特异性增强（图4）。研究表明，肿瘤细胞接收到的SPP1信号主要来源于CXCL9+TAMs以外的细胞，如TREM2+TAMs和RTM+TAMs，其中TREM2+TAMs是PSN-MLC阶段单核细胞源性巨噬细胞比例最高的细胞。
图4免疫微环境中淋巴样细胞浸润特征的变化及在GGN-和PSN-LUAD进展和转移中的作用
5. IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的相互作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭转移的进展
随后，研究人员探索了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs之间的信号转导在GGN-和PSN-LUAD侵袭和转移中的重要机制。在CXCL9+TAMs中，IFN-γ反应、炎症反应和P53_PATHWAY等通路更加活跃；在TREM2+TAMs中，血管生成、EMT和NOTCH_SIGNALING等通路更活跃。IFN-γ反应途径活性的评分结果表明其在CXCL9+TAMs中表现出较高的活性。与不同GGN-LUAD分期相比，PSN-LUAD的IFN-γ信号通路活性较低。根据Cellchat分析结果，研究人员评估了在GGN-和PSN-LUAD侵袭和转移过程中IFN-γ信号的来源：GGN-LUAD侵袭过程中，多种免疫细胞释放IFN-γ：CD8+Trm细胞、CD8+GZMK_Teff、CD8+GNLY_Teff和Classical_NK细胞；在PSN-LUAD侵袭过程中，IFN-γ仅由NK细胞和CD8+Trm细胞释放。这解释了在PSN-LUAD的侵袭阶段，CXCL9+TAMs和CD8+Trm细胞之间的相互作用减弱。
为了进一步阐明IFN-γ对CXCL9+TAMs分化的影响，研究人员对IFN-γ应答基因、调节CXCL9表达的高活性转录因子和与CXCL9+TAMs序贯分化相关的基因进行分析，发现STAT1能够响应IFN-γ的诱导，并调节下游CXCL9相关基因的表达，从而影响CXCL9+TAMs的分化。此外，与其他TAMs相比，STAT1在CXCL9+TAMs中表现出更高的表达水平。通过对STAT1和CXCL9在肿瘤发展不同阶段的表达水平进行相关性分析，研究人员证实了STAT1和CXCL9之间的调控关系。在对TREM2+TAMs的不同分化阶段（SPP1 +和SPP1-）的分析中，转录因子NFATC1（+）、EGR3（+）、KLF6（+）和MAF（+）在TREM2+/SPP1-TAMs分化阶段表现出高活性表达。结合TREM2+ /SPP1+TAMs和TREM2+/SPP1-TAMs的DEG分析，研究人员发现EGR1、FOSB和STAT3在TREM2+/SPP1-TAMs中显著上调。此外，研究人员发现BHLHE41（+）和NR1H3（+）可以直接调控SPP1的表达，在诱导TAMs向SPP1+表型发展中起关键作用（图5）。
图5 IFN-γ调控CXCL9+TAMs与CD8+Trm细胞之间的相互作用，影响GGN-和PSN-LUAD侵袭转移的进展
6. 体内验证IFN-γ/STAT1通路在LUAD发生发展中的作用
研究人员分析了1590例原发性LUAD样本，并确定了LUAD中最常见的突变基因，其中TP53（47%）和KrasG12D（36%）是最常见的两个癌基因。从CAG-Cas9-EGFP小鼠肺组织中分离AT2细胞并培养形成肺类器官。然后，sgRNAs和cDNAs被引入这些类器官中，以敲除和过表达与人类肺腺癌相关的基因(Trp53−/−；KrasG12D)。明场图像显示WT类器官显示出组织良好的囊性结构，Trp53-/-类器官显示出多层上皮成分，而TK类器官形成了排列紊乱的固体肿块。Ki-67染色显示TK类器官具有较高的增殖率（图6）。
将经过基因编辑的TK类器官移植到小鼠肺内，并使用荧光素酶活体成像和微型计算机断层扫描进行监测。活检显示注射部位单个病灶有特异性绿色荧光蛋白（GFP）表达，提示肿瘤起源于移植的类器官。HE染色和免疫组化结果显示，3周时出现早期LUAD，7周时进展为LUAD，11周时恶性程度更高。RNA-seq结果表明，随着LUAD的发生和进展，免疫细胞浸润逐渐减少，这一发现与单细胞转录组学的结果一致，提示随着疾病的进展，肿瘤微环境中发生了免疫细胞耗竭。3、7、11周Western blot结果显示，IFN-γ、STAT1、p-STAT1、CXCL9、CD8蛋白表达水平逐渐降低，SPP1、CD44蛋白表达水平逐渐升高。并对3个阶段小鼠血清进行ELISA验证，结果与单细胞转录组学数据一致，表明单细胞转录组学结果的可靠性（图7）。
图6癌前肺类器官中Trp53−/−；KrasG12D驱动基因的生成
图7利用工程化肺类器官在小鼠中建立不同阶段LUAD模型
小结
该研究证实了GGN-和PSN-LUAD的细胞组成和免疫应答存在显著异质性，并进一步揭示了CXCL9+TAMs和TREM2+TAMs及其调控基因在LUAD进展不同阶段的差异富集和相互作用模式。IFN-γ通过激活STAT1信号通路和调节CXCL9+TAMs与CD8+Trm之间的相互作用影响GGN-和PSN-LUAD的侵袭和转移。
参考文献
Ren YF, Ma Q, Zeng X, Huang CX, Ren JL, Li F, Tong JJ, He JW, Zhong Y, Tan SY et al: Single-cell RNA sequencing reveals immune microenvironment niche transitions during the invasive and metastatic processes of ground-glass nodules and part-solid nodules in lung adenocarcinoma. Molecular cancer 2024, 23(1):263. DOI: 10.1186/s12943-024-02177-7.
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来源：培养盒守护者