摘要：近年来，单细胞组学技术经历了从最初的单细胞 mRNA 测序到高通量方法，再到如今能够在同一细胞内捕获多种组学模态的跨越式发展。然而，要全面理解单个细胞及其在组织中的相互作用，保留其空间背景信息至关重要。

近年来，单细胞组学技术经历了从最初的单细胞 mRNA 测序到高通量方法，再到如今能够在同一细胞内捕获多种组学模态的跨越式发展。然而，要全面理解单个细胞及其在组织中的相互作用，保留其空间背景信息至关重要。

近日，宾夕法尼亚大学邓彦翔团队在Nature Methods上发表了文章Multiplexed spatial mapping of chromatin features, transcriptome and proteins in tissues，开发了一种全新的空间多组学技术——Spatial-Mux-seq。该技术能够原位同时捕获染色质可及性、两种组蛋白修饰、转录组以及蛋白质表达，为解析跨越基因调控各层次的复杂网络提供了全新的视角。

在细胞内，DNA为基因转录提供模板，生成的 mRNA随后 被翻译成蛋白质，而这一过程的每一步都受到精密调控。组蛋白与DNA缠绕形成核小体，并通过翻译后修饰调节染色质的紧密程度和基因转录的可及性。染色质可及性 （Chromatin accessibility） 和组蛋白修饰 (Histone modification) 不仅是细胞多样性和功能的关键调控因素，其失调可能引发多种疾病。虽然现有的多组学方法已让我们得以探索不同层次的基因调控，但能够在原位同时捕获这些信号的技术却屈指可数。Spatial-Mux-seq 正是在这一背景下应运而生，为全面解析细胞调控网络提供了强有力的技术支持。

Spatial-Mux-seq 采用了一系列条形码化策略，将每种组学模态的信号精准捕获并赋予空间定位（图 1）。首先，像染色质转座酶可及性测序 （ATAC-seq） 一样， Tn5 转座酶标记组织切片中的可及染色质区域 （Chromatin accessibility region） 。接下来，将组织切片同时与两种不同物种来源的一抗进行孵育 （例如，Anti-mouse H3K27me3/anti-rabbit H3K27ac） ，再通过物种特异性的二抗 nanobody–Tn5 融合蛋白，分别结合到相应的一抗并在相应区域 进行DNA切割，并插入包含模态条形码的Tn5 接头序列。然后，使用寡核苷酸偶联抗体检测细胞表面蛋白的表达，并通过原位逆转录捕获细胞 信使RNA （mRNA） 以及寡核苷酸单链。最后，利用微流控芯片，将一组预定义的 DNA 条形码分布在组织切片上，创建空间条形码 “像素” ，最终形成二维空间网格。每个步骤引入的连接序列最终与空间条形码结合，使得每个空间“像素”内的ATAC-seq、CUT&Tag ，mRNA， 和蛋白共享相同的空间条形码，以便后续的多模态整合分析。

图1. Spatial-Mux-seq 技术流程。

研究团队在不同组织类型和空间分辨率下对Spatial-Mux-seq进行了系统验证，展示了其在多场景下的应用潜力。应用于小鼠胚胎时（图 2），Spatial-Mux-seq在50微米的空间像素中成功检测出胚胎中已知的组织特异性细胞类型，并揭示了活跃 （例如，H3K27ac/H3K4me3） 和抑制性 （例如，H3K27me3） 组蛋白标记如何在神经元细胞中协调基因表达。通过伪时间分析，作者对发育轨迹进行空间映射，作者检测到标志基因如 Sox2 表达的动态变化。Sox2 是神经元前体的主要调控因子，放射状胶质细 胞 (Radial glia) 中观察到 Sox2 基因表达、染色质可及性和 H3K4me3 富集的增加，而抑制性 H3K27me3 水平保持较低。随着这些细胞转变为成熟神经元，其调控特征的动态变化可以在组织中清晰地追踪。在小鼠脑冠状切片的分析中，作者展示了多模态剖析在研究细胞多样性中的重要性。通过同时检测H3K27me3、H3K27ac 和转录组，Spatial-Mux-seq精准揭示了海马前体细胞的表观遗传多样性，这些研究描述了表观遗传修饰在调控神经干性中的关键作用。

图2. Spatial-Mux-seq 在小鼠胚胎中的全景分析及应用。

在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (experimental allergic encephalomyelitis，EAE) 模型中，团队使用了100x100的微流控设备，以20微米的分辨率对10,000个空间点进行五种模态的标记。通过聚类分析，重构了小鼠大脑的解剖结构，并捕获了主要细胞类型（图 3a）。此外，Spatial-Mux-seq揭示了关键基因在 mRNA 与蛋白表达上的区域性差异。例如，在胼胝体 （corpus callosum） 区域（图 3b）， CD140a 蛋白的表达呈现高度局部化的模式，而 RNA 信号则较为弥散。染色质可及性与CD140a蛋白空间分布的密切相关；组蛋白修饰为这一调控机制增添了复杂性。H3K27ac 通常与活跃的增强子相关，显示出更广泛的分布，并未直接与 CD140a 蛋白的空间表达相对应。相反，H3K27me3 展示了明显对立的空间模式，表明某些 CD140 同义异构体可能在表观遗传层面受到抑制。进一步分析发现，胼胝体中最长的 CD140 同义异构体 RNA 表达较高，其转录起始位点 (TSS) 处的 H3K27me3 信号明显降低。这表明，表观遗传修饰可能选择性地允许某些同义异构体的转录，而抑制其他异构体，突显了表观遗传机制在精确调控基因表达中的重要性。

图3. Spatial-Mux-seq捕获五种模态的高分辨率空间组织结构。

总之，Spatial-Mux-seq 技术实现了在单一组织切片中同时捕获染色质可及性、组蛋白修饰、转录组和蛋白质表达，为我们提供了一种全新的平台，以多维度解析基因调控的内在逻辑。该技术不仅具备高空间分辨率，还能在小鼠胚胎和成年大脑等模型中揭示不同细胞类型的表观遗传和转录动态，预计将在揭示组织发育和疾病机制方面发挥重要作用。作为空间组学领域的一项突破，Spatial-Mux-seq 为未来生物医学研究开辟了全新的视野。

宾夕法尼亚大学邓彦翔课题组博士后郭朋飞和博士生毛丽然为该论文的共同第一作者。宾夕法尼亚大学助理教授邓彦翔，以及瑞典斯德哥尔摩大学助理教授Marek Bartosovic为该论文的通讯作者。

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来源：科学小五说