摘要：超分辨显微技术 (Super-Resolution Microscopy)以突破光学显微镜衍射极限(横向约200 nm，轴向约500 nm)为目标，在光学成像领域取得了革命性进展。这些技术根据原理可分为不同的类别，其发展历程大致如下：
超分辨显微技术 (Super-Resolution Microscopy)以突破光学显微镜衍射极限(横向约200 nm，轴向约500 nm)为目标，在光学成像领域取得了革命性进展。这些技术根据原理可分为不同的类别，其发展历程大致如下：
1. 受激辐射损耗显微镜(Stimulated emission depletion, STED): 1994年，由Stefan Hell和Jan Wichmann提出，利用一束激发激光和一束环状耗尽激光，选择性熄灭荧光分子，缩小光点的有效点扩散函数(PSF)，从而提升分辨率，实现了20-50 nm的分辨率，首次超越光学衍射极限，STED广泛用于观察亚细胞结构和分子动态，成为超分辨显微的奠基技术之一;
2. 单分子定位显微技术 (Single-molecule localization microscopy，SMLM): SMLM是基于单分子定位原理的显微技术，包括: 光激活定位显微镜 (2006年，由Eric Betzig和Harald Hess提出，通过光激活稀疏荧光分子，并逐一记录其位置，以构建高分辨图像)，随机光学重建显微镜 (2006年，由Xiaowei Zhuang团队提出，利用荧光染料的随机开关行为，记录单分子位置并重构图像)，纳米尺度表面形态的DNA点积成像 (2006年，由Robin Hochstrasser团队开发，通过探针分子与目标分子的瞬时结合产生的闪烁信号，生成高分辨图像);
3. 最小荧光光子通量显微技术 (minimal photon fluxes，MINFLUX): 2016年，由Stefan Hell团队开发，结合单分子定位与光学坐标靶向成像，通过最小化荧光光子通量实现纳米级分辨率，优于传统方法，达到3-5 nm，更少的光子需求，适用于对光损害敏感的样品；
4. 超分辨光学波动成像 (Super-resolution Optical Fuctuation Imaging, SOFI): 2009年，由Jörg Enderlein团队首次提出，通过分析荧光信号的时间波动相关性，利用高阶积数提高分辨率，无需单分子定位，适用于高荧光密度样品，而且成像速度快，特别适合活细胞成像。
图一: a. 原始SOFI数据: 原始数据为显微镜采集的一组样本视频帧堆叠而成。与单分子定位显微技术(SMLM)相比，SOFI能处理更高密度的荧光标签，因为其不依赖分子间信号的完全分离，SOFI利用发射体间信号的时间相关性，跨发射体的信号交叉相关性为零，这使得分辨率得以提升；b. SOFI 的共聚焦切片能力，SOFI为宽场显微镜赋予了类似共聚焦显微镜的光学切片能力；c. 三维SOFI成像，图中展示了用Alexa 647染料标记线粒体的三维成像结果，样本为固定的C2C12细胞，第三阶平衡SOFI图像的最大强度投影覆盖了65 × 65 × 3.5 µm³的体积，显现了三维结构细节。
图二: SOFI 的光学传递函数(OTF)与点扩散函数(PSF)。左列:OTF 的横向-轴向截面，显示了宽场显微镜(顶部)及二阶到四阶SOFI图像的OTF横向-轴向截面(以对数密度图形式呈现)OTF的扩展范围代表了成像系统的空间频率支持能力，从二阶到四阶SOFI，OTF通过自卷积逐步扩展，频率支持范围增加，表明分辨率显著提升；第二列: PSF的横向-轴向截面，以线性密度图展示了宽场显微镜和不同阶数 SOFI 图像的 PSF，从宽场显微镜到高阶 SOFI，PSF的宽度逐步缩小，表明成像分辨率不断提高；第三列: 理想OTF，通过宽场显微镜的OTF自卷积得到，并将所有非零幅值设为零，三阶与四阶 SOFI的理想OTF为二阶 SOFI理想OTF的缩放版本，展现了更高频率支持能力；第四列: 不同阶SOFI的PSF，不同阶SOFI图像的PSF通过计算生成，进一步展示了分辨率随着SOFI阶数增加而提升的效果高阶 SOFI 的 PSF 表现出更尖锐的峰值，意味着空间分辨率的大幅提升。
图三: 像素大小问题及解决方案，图像的分辨率受限于像素大小。这种像素限制可能引入伪影，影响图像质量。a. 傅里叶上采样(Fourier Upsampling); b. 像素间交叉相关(Pixel Cross-Correlation); c. 图像堆叠的总和图(Sum Image):展示了未处理的原始数据; (d) 二阶 SOFI 图像: 通过时间相关分析生成，分辨率显著提升; (e) 经过3×傅里叶上采样的二阶 SOFI 图像: 像素化问题完全消除，分辨率进一步提高，图像细节更加清晰。解决 SOFI 中像素限制问题的两种方法，尤其是傅里叶上采样，其能够以无伪影的方式显著提升图像质量。结合时间相关性和频域处理，SOFI 在保持高分辨率的同时，克服了像素大小带来的技术瓶颈，为高分辨成像提供了更灵活的选择。
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来源：凯视迈精密测量
