前献解泌第43期 | 刘川教授与您共同探讨基于染色质图谱的去势抵抗性前列腺癌分型的临床意义

摘要：本期与我们用声音见面的是重庆医科大学附属第二医院刘川教授，他将与大家一同分享一项发表于《Science》杂志（影响因子：44.7）的一项有关基于染色质图谱的去势抵抗性前列腺癌分型提示潜在治疗靶点的研究。

聚前沿文献之声，解泌尿学术之

聚前沿文献之声，解泌尿学术之惑，这里是聚焦前列腺癌的《菲长视野 · 前献解泌》专栏。

本期与我们用声音见面的是重庆医科大学附属第二医院刘川教授，他将与大家一同分享一项发表于《Science》杂志（影响因子：44.7）的一项有关基于染色质图谱的去势抵抗性前列腺癌分型提示潜在治疗靶点的研究。

研究背景

未经治疗的前列腺癌的生长和发展依赖于雄激素受体（androgen receptor，AR）信号，这也是雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy，ADT）治疗前列腺癌的基础。但多数前列腺癌会在治疗后复发，并最终进入致命阶段，称之为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），AR信号的再激活是CRPC生长的常见驱动因素。目前，ADT联合新一代AR信号抑制剂（AR signaling inhibitors，ARSIs）是CRPC的一线治疗方案。但是，ARSIs带来的选择性压力可能会导致AR非依赖性前列腺癌的产生。前列腺癌从AR依赖性转变为AR非依赖性的过程中往往伴随着类似发育转分化或谱系可塑性的表型变化。神经内分泌前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer，NEPC）是谱系可塑性研究最多的一种前列腺癌分型，但多数AR阴性前列腺癌不表现神经内分泌特征，被定义为“双阴性前列腺癌”（double-negative prostate cancer，DNPC），其驱动因素尚不明确。

目前，由于缺乏重现疾病谱系特征的患者来源模型，CRPC的机制研究受到了一定的限制。为此，研究者建立了一个由患者活检产生的类器官生物库，以研究转移性CRPC（metastatic CRPC，mCRPC）的情况，并允许进行功能验证[1]。

研究方法

本项研究首先建立了患者来源的mCRPC类器官生物库，并使用转座酶可及性染色质测序（assay for transposase accessible chromatin with high throughput sequencing，ATAC-seq）、核糖核酸测序（ribonucleic acid，RNA-seq）、脱氧核糖核酸测序（deoxyribonucleic acid，DNA-seq）研究类器官、患者来源的异种移植模型（patient-derived xenografts，PDXs）和细胞系，在AR依赖性前列腺癌和NEPC之外，鉴别出两种AR阴性/低表达亚型，为Wnt依赖性前列腺癌和干细胞样（stem cell-like，SCL）前列腺癌亚型，揭示了前列腺癌治疗的潜在靶点，为临床决策提供信息。

研究结果

● mCRPC患者来源的类器官生物库

研究者从mCPRC患者的标本中表征并生成了15个类器官，这些类器官来源于侵袭性前列腺癌、对初始ADT治疗反应短、接受ARSIs二线治疗后进展较快的患者。多数类器官表现出与活检相同的拷贝数变异（copy number variations，CNVs）和单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）（图1A-B）。

图1 依据染色质可及性将mCRPC分为4种亚型

● 染色质可及性揭示转移性前列腺癌的四种分子亚型

研究者对35个转移性前列腺癌模型进行ATAC-seq，包括22个患者来源的类器官，6个PDXs和7种细胞系（每一个进行2次生物重复）。此外，研究还纳入了已发表数据的5种NEPC模型的ATAC-seq数据（图1C）。总体而言，研究者确认了861,195个可重复峰，大多数ATAC-seq峰映射到远端基因间和内含子区域。研究通过k均值聚类法在可及性变化最大的区域确定了4种CRPC亚型，与层次聚类法和统一流形近似和投影法（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）得到的结果类似（图1D-E）。

其中一种mCRPC亚型由AR高表达样本组成，包括4种细胞系（LNCaP、VCaP、22Rv1和C4-2）、3个类器官（MSKPCa2、MSKPCa19和MSKPCa22）和5个PDXs（图1F），所有上述样本的AR靶基因（例如KLK2）的染色质可及性均增加。另一种亚型为NEPC亚型，包括已发表的NEPC样本（H660、WCM154、PARCB1、PARCB3、PARCB6、PARCB8和MSKEF1[已发表的神经内分泌器官IDMSKPCA4的衍生物]）、3个新的类器官（MSKPCa10、MSKPCa14和MSKPCA24）和1个SYP高表达伴小细胞癌表型的PDX。剩余两种亚型分别为神经内分泌阴性（neuroendocriNE-negative，NE-negative）和AR阴性/低表达亚型（图1E-F）。

● 4种CRPC亚型的转录组学特征

随后，研究者通过UMAP分析了40个样本的转录组，结果与ATAC-seq的结果一致（图2A）。研究使用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和选择性标记基因表达对4种亚型进行命名：（1）CRPC-AR，AR信号富集；（2）CRPC-WNT，Wnt信号富集；（3）CRPC-NE，NE特征富集；（4）CRPC-SCL，包含SCL样本（11个类器官、DU145和PC3细胞系）。

CRPC-SCL此前从未被发现过，这类样本富含乳腺干细胞特征，高表达肿瘤干细胞标志物CD44和TACSTD2（TROP2A）（图2B-C）。与CRPC-AR相比，其他3种亚型均富含基底特征以及前列腺干细胞特征，其中CRPC-SCL的富集评分最高并表达基底细胞标志物（图2C）。此外，与另外两种亚型相比，CRPC-WNT和CRPC-SCL表现出成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）信号的富集，这一结果与既往报道的AR阴性/低表达前列腺癌的结果一致。

图2 4种CRPC亚型的转录组和基因组特征

● 4种CRPC亚型中肿瘤抑制因子的基因组特征和缺失情况

研究发现，CRPC-AR亚型样本富含AR扩增和/或AR突变。而在CRPC-WNT亚型中，所有4个样本均显示出Wnt信号通路的改变，其中3个样本在CTNNB1（β-catenin）中显示了热点突变（图2D）。既往研究表明，肿瘤抑制因子TP53、PTEN和RB1缺失与CRPC的谱系可塑性和侵袭性有关。研究发现，TP53是最常见的突变基因，4组中23/35（66%）的样本存在TP53突变或深度缺失。RB1和PTEN分别在20%和43%的样本中出现双等位基因改变。总体而言，与CRPC-AR亚型（2/12）相比，RB1缺失在AR阴性/低表达样本（14/24）中富集；而CRPC-AR与其他亚型之间PTEN和TP53的差异无统计学意义。近期研究表明，在前列腺癌中，TP53和RB1缺失会减弱AR信号，但并非都会诱导产生神经内分泌样表型。RB1突变，而非TP53和PTEN突变，与AR非依赖性CRPC预后较差有关，与本研究的观察结果一致，进一步证实了转录组学和表观遗传学在CRPC分型中的重要作用。

● 构建调控网络并鉴别关键转录因子（transcription factor，TF）

为了确定驱动亚型特异性转录组的关键TF，研究者通过整合ATAC-seq和RNA-seq的数据构建调控网络，并依据ATAC-seq峰的染色质可及性以及±0.5Mb范围内基因表达的相关性，建立峰-基因间的关联（图3A-C）。随后，研究者通过HINT-ATAC法（基于ATAC-seq，利用Hmm模型识别TF足迹），对809个（来自于CIS-BP数据库）TF进行序列集合基序的收集。通过结合峰-基因和TF-峰之间的关系，研究者构建了TF-基因的关联，并生成了样本特异性的调控网络（图3A）。

接下来，研究者确定了每种亚型的关键TF（图3D）。研究显示，在CRPC-AR亚型中，排名前两位的TF为AR和FOXA1。而在CRPC-NE亚型中，排名前两位的TF为NEUROD1和ASCL1，这两者也是小细胞肺癌的主要驱动因子。在CRPC-WNT亚型中，TCF7L2是排名最高的TF，TCF7L2也被称为TCF-4，是结直肠癌上游Wnt通路基因改变如APC突变的关键驱动因子。在CRPC-SCL亚型中，AP-1家族的转录因子排名靠前，其中FOSL1的排名最高。

图3 鉴别每个亚型的关键IF

● 利用4种亚型的转录组特征对CRPC患者进行分类

研究分析了366例CRPC患者的RNA-seq数据，结合排名靠前的基因特征，为每种亚型构建模板，通过最近模板预测（Nearest Template Prediction，NTP）算法将患者分入4种亚型（图4A）。研究者将该方法用于两组具有polyA富集RNA-seq数据的CRPC患者队列，分别为266例已发表的患者数据（SU2C）和威尔康奈尔医学院（Weill Cornell Medicine，WCM）测序得到的100例患者的数据（图4B）。

结果显示，在两个队列中，4种亚型患者的相对比例相似，CRPC-AR亚型最多，随后是CRPC-SCL或CRPC-NE，最后是CRPC-WNT（图4C）。基因组改变、标记基因表达和病理分析进一步验证了患者分类。与其他亚型相比，CRPC-AR亚型患者表现为AR扩增富集以及更高的AR表达和AR评分（图4B、D）。而CRPC-NE亚型患者的SYP表达和NE评分较其他亚型更高，且具有RB1深度缺失富集。CRPC-WNT亚型患者AXIN2高表达且Wnt通路突变富集。CRPC-SCL亚型患者干细胞标志物CD44表达增加，但在基因组水平上没有出现基因富集或通路改变。在SU2C队列的266例患者中，56例患者具有新一代ARSIs（恩扎卢胺或醋酸阿比特龙）的治疗时间数据。经分析发现，CRPC-SCL亚型的患者接受ARSIs治疗的时间较短，说明ARSIs治疗对CRPC-SCL亚型患者的疗效较差（图4E）。

图4 使用4种亚型的转录组特征对CRPC患者进行分类

● 在CRPC-SCL中AP-1、YAP、TAZ和TEAD协同作用

在SU2C和WCM合并队列中，CRPC-SCL亚型患者的占比为第二高（28%），研究者进行了进一步探索。研究选用AR低表达类器官模型（MSKPCa3）和AR阴性细胞系（DU145）作为CRPC-SCL模型进行实验验证。此前研究表明，AP-1家族的FOSL1是CRPC-SCL亚型的关键TF，研究者通过细胞竞争实验进一步证实了FOSL1在肿瘤生长中发挥重要作用（图5A）。除了AP-1之外，研究发现在CRPC-SCL亚型中，TEAD的富集程度也很高，且TEAD由YAP和TAZ共同激活。基于ATAC-seq数据和已发表的文献，研究者假设AP-1（FOSL1）、YAP、TAZ和TEAD协同作用，促进CRPC-SCL肿瘤生长，GSEA实验也观察到了YAP/TAZ的强富集（图5B-C）。

随后，研究者在MSKPCa3和DU145中进行染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）实验以验证AP-1（FOSL1）、YAP、TAZ和TEAD的共同结合。结果显示，在MSKPCa3和DU145中，上述4种蛋白的重叠显著富集，表明其存在协同作用（图5D-E）。更重要的是，这4种蛋白的ChIP-seq峰均与CRPC-SCL的ATAC-seq峰重叠，几乎不与CRPC-AR的峰重叠（图5F）。

图5 在CRPC-SCL中AP-1、YAP、YAZ和TEAD协同作用

● AP-1和YAP/TAZ对CRPC-SCL亚型特异性染色质可及性和基因表达具有重要作用，是药物的潜在靶点

AP-1和YAP/TAZ敲低对染色质可及性和基因表达有影响：研究者在同时敲低AP-1、YAP、TAZ和YAP/TAZ的MSKPCa3细胞中进行ATAC-seq和RNA-seq。在CRPC-SCL特异性开放染色质位点以及ChIP-seq中FOSL1、TEAD、YAP和YAZ的结合区域观察到，敲低FOSL1、YAP和YAP/TAZ后，染色质可及性降低（图6D-E）；且该信号在FOSL1敲低和YAP/TAZ双敲低时最强，表明其在维持CRPC-SCL染色质可及性景观中的重要作用。与ATAC-seq结果一致，研究者发现在所有敲低实验中，RNA-seq数据中YAP/TAZ靶标均下调（图6F）。双敲低YAP和TAZ对下游靶点（CTGF、CYR61、AJUBA和ANKRD1）和细胞周期调节基因（CCND1）的抑制作用更强（图6A）。

图6 敲低FOSL1、YAP、TAZ和YAP/TAZ的影响

YAP/TAZ和FOSL1之间的正反馈：研究发现，双敲低YAP/TAZ会导致FOSL1在RNA和蛋白水平的强烈消耗（图6A-B）。ChIP-seq数据显示，CRPC-SCL特异性FOSL1的增强子与TEAD、YAP、TAZ和FOSL1结合。上述数据表明，TEAD、YAP、TAZ和FOSL1均会增加FOSL1基因的表达，形成一个正反馈循环，进一步打开染色质。外源性FOSL1表达改变了CRPC-AR到CRPC-SCL的染色质可及性和基因表达：为了确定AP-1是否可以改变染色质可及性景观并激活CRPC-SCL信号，研究者在LNCaP细胞中稳定单独表达AP-1，或者联合YAP或TAZ表达AP1。在所有外源性表达FOSL1的实验中，CRPC-SCL特异性开放染色质位点的染色质可及性增加，这为其作为潜在谱系可塑性的先驱因素的作用提供证据（图7A-B）。RNA-seq与ATAC-seq结果一致，无论是单独过表达FOSL1还是联合TAP或TAZ过表达，均可观察到CRPC-SCL特征基因的表达（图7C）。

图7 AP-1和YAP/TAZ是CRPC-SCL亚型药物作用的潜在靶点

CRPC-SCL的小分子抑制剂：研究者观察了作用于YAP/TAZ/AP-1通路的小分子抑制剂对CRPC-SCL的潜在治疗作用，发现与对照组相比，MSKPCa3和DU156细胞对此类药物更敏感，肿瘤生长受到抑制（图7D-E）。

● YAP/TAZ通路在CRPC-SCL亚型患者中富集

最后，研究者检测了SU2C和WCM队列患者转录组数据中的YAP/TAZ活性，发现CRPC-SCL患者中YAP/TAZ通路显著富集（图7E）。同时，研究还发现在SU2C样本中AR表达与YAP/TAZ通路活性显著负相关（图7G）。

研究结论

研究使用mCRPC类器官、PDX和细胞学的多种类生物库，描述了转移性前列腺癌的基因型和表型异质性，生成了CRPC的染色质可及性和转录组图谱，并以此将CRPC分为4种亚群，并发现了此前未被定义的CRPC-SCL亚型，占比约为28%，仅次于CRPC-AR亚型。研究表明，AP-1与YAP/TAZ和TEAD蛋白相互作用，以维持CRPC-SCL亚型特异性染色质可及性和转录组景观，为我们揭示了这类前列腺癌的潜在治疗靶点，为日后的前列腺癌精准治疗提供帮助。

专家有话说

mCRPC患者的异质性较强，患者生存预后较差，一直是前列腺癌治疗的难点。本研究利用类器官、PDX和细胞学的多种类生物库，研究并发现了全新的干细胞样前列腺癌亚型，指出AP-1与YAP/TAZ和TEAD蛋白相互作用是维持该亚型前列腺癌特异性染色质可及性和转录组景观的关键，也为日后的临床研究提供了新的视角与方向。基础研究的不断深入使我们对前列腺癌的发生发展以及耐药相关的分子机制有了更多的了解，以此研发新的靶向药物或许可以为晚期前列腺癌的精准治疗带来更多可能，但基础研究成果距离临床转化还有很长的路要走。

基于雄激素在前列腺癌发生发展中的重要作用，ADT一直是前列腺癌治疗的基石方案，并贯穿全程。以曲普瑞林为代表的ADT药物可以有效降低并维持低水平的睾酮和前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA），其6月长效剂型也已获批进入临床实践，在保持疗效的基础上，为中国前列腺癌患者带来了更为长效的疾病控制方案。一项开放标签、非比较、多中心，III期注册试验，纳入了120例晚期前列腺癌患者，在24周间隔内连续两次肌内注射曲普瑞林6月剂型。基线时测量睾酮水平，然后每4周复查一次。结果显示，患者接受曲普瑞林6月剂型治疗29天时，97.5%的患者睾酮可达到去势水平（睾酮≤50 ng/dl），且在第2-12个月治疗期间93.0%的患者可维持去势状态；同时，在患者接受曲普瑞林6月剂型治疗第1天、第12、24、36和48周时检测PSA，结果显示，在第6个月和治疗结束时，患者中位PSA相对于基线时分别降低97%和96%。此外，长效剂型在改善诊疗体验方面的优势也使其备受临床医生和患者青睐。法国的一项为期1年的前瞻性观察研究分析了1438例前列腺癌患者接受促黄体激素释放激素激动剂（luteinising-hormone releasing hormone agonist，LHRH-a）治疗第3、第6和第12个月时的医生处方及患者偏好。结果显示，初始使用6月剂型治疗的患者比例（n=903，62.8%）高于初始使用3月剂型治疗的患者比例（n=535，37.2%），治疗12个月后，71%的患者维持原有治疗方案。共201例患者在随访期间变更了治疗方案，其中170例（84.6%）患者从初始使用3月剂型更换为6月剂型，医生选择处方6月剂型最常见原因是“治疗方案简化”（86.9%）和“减少不必要的就诊”（46.8%）[3]。

曲普瑞林在前列腺癌领域累积了丰富的循证医学证据和使用经验，已成为临床实践中最常使用的ADT药物之一，6月剂型进一步减少了注射次数，有助于减轻患者负担，提高患者的诊疗便利性与治疗依从性。相信随着曲普瑞林6月剂型在临床实践中的逐渐普及，前列腺癌患者的诊疗体验将迈向新高度。

专家简介

刘川教授

重庆医科大学附属第二医院

重庆医科大学附属第二医院副主任、教授、医学博士、硕士研究生导师

中国抗癌协会泌尿肿瘤专委会委员

中国初级卫生保健基金会泌尿外科专业委员会委员

中国中西医结合学会泌尿外科专委会转化医学学组委员

海峡两岸医药卫生交流协会泌尿外科专委会第一届单孔学组委员

重庆市医学会微创外科学专业委员会委员、常委；泌尿学专委会秘书

重庆市医学会泌尿外科专业委员会肿瘤学组副组长

重庆市医师协会微无创分会秘书、泌尿外科专委会委员