摘要：Caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎症性caspase家族的重要成员，在人类固有免疫应答中发挥关键作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）激活非经典炎症通路，进而切割Gasdermin D（GSDMD）并介导细胞焦亡（pyroptosis）和炎症因

Caspase-4（半胱天冬酶-4）是炎症性caspase家族的重要成员，在人类固有免疫应答中发挥关键作用。它通过直接识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）激活非经典炎症通路，进而切割Gasdermin D（GSDMD）并介导细胞焦亡（pyroptosis）和炎症因子释放。尽管底物鉴定对解析Caspase-4的生物学功能与调控网络至关重要，但由于酶-底物相互作用瞬时性及切割效率低下等挑战，传统基于酶切产物富集的方法难以系统揭示其底物谱系。

近日，清华大学药学院尹航课题组创新性地将基因密码子扩展与光交联蛋白质组学结合，开发了一种高效捕获Caspase底物的新方法。该技术突破了传统酶活性依赖策略的局限性，为焦亡及相关信号通路研究提供了强有力的工具。

研究人员基于Caspase-4与底物GSDMD的互作界面，利用基因密码子扩展技术，将光敏非天然氨基酸pBpa精准嵌入Caspase-4的底物结合区域（K356位点），构建了光交联探针CASP4（C258A）-3C-pBpa。并巧妙引入三重功能模块：第一，通过C258A催化位点突变消除蛋白酶活性，避免底物降解导致的信号丢失；第二，插入HRV-3C蛋白酶切割位点维持天然构象与底物结合能力；第三，利用pBpa的光交联特性共价锁定瞬时相互作用。该探针成功克服传统方法的技术瓶颈，实现了对弱结合底物的高效捕获。

图1.光交联探针设计与验证

研究人员首先采用高分辨质谱等技术对构建的光交联探针进行分子表征，确认探针的分子量及结构完整性。通过底物切割实验与蛋白质互作分析，证实探针的结构修饰（包括催化位点失活突变与蛋白酶切位点插入）未影响Caspase-4的天然构象与功能特性。体外交联实验显示，该探针能够在紫外激活下高效捕获已知底物GSDMD，并系统性富集裂解液中的相互作用蛋白，展现出显著优于传统方法的底物捕获能力。

结合定量蛋白质组学（Label-Free Quantification, LFQ），研究人员从THP-1细胞裂解液中鉴定出156种潜在底物。为验证技术可靠性，研究人员选取部分候选蛋白进行体外切割实验，证实了包括AKT1、CASP5/12在内的16种蛋白可被Caspase-4切割。这些实验结果不仅验证了光交联探针技术的高效性与准确性，更通过新底物的发现为解析焦亡通路中酶-底物结合特异性、信号交叉调控等关键科学问题提供了重要线索。

图2.组学分析与底物验证

在众多新发现的底物中，尤其值得关注的是，研究首次揭示Caspase-4可通过特异性切割AKT1的D108位点，移除其PH自抑制结构域，释放激酶活性核心。这一发现提示细胞焦亡通路可能通过AKT1调控网络与细胞存活、代谢等进程产生交叉对话。此外，Caspase-4对同家族蛋白酶Caspase-5/12前体的激活作用，揭示了炎症性caspase间存在级联放大机制，为先天免疫应答调控提供了新视角。

该研究通过技术创新与方法学突破，成功构建了具有光亲和能力的Caspase-4光交联探针系统，解决了caspase底物鉴定的关键难题。研究不仅系统扩展了Caspase-4的底物谱系，更揭示了其通过切割AKT1等关键调控蛋白实现焦亡通路与细胞稳态网络的跨维度对话，以及通过激活同源蛋白酶形成级联放大效应的新机制。这些发现为深入解析细胞焦亡的分子调控网络、阐明感染性疾病与炎症相关疾病的发病机理提供了重要理论依据，同时发展的技术平台为其他瞬时弱相互作用酶-底物系统的研究提供了普适性解决方案。

相关研究成果以“位点特异性光交联蛋白质组学方法解析焦亡关键酶Caspase-4底物网络”（A Site-Specific Photo-Crosslinking Proteomics Approach Provides Insights into Non-Canonical Pyroptotic Caspase-4 Substrates）为题，于3月12日发表于《德国应用化学》（Angew.Chem.Int.Ed.）。

清华大学化学系博士生周易为论文第一作者，清华大学药学院教授尹航为论文通讯作者。药学院博士生张新宇参与了此项工作。研究得到国家自然科学基金、国家卫健委基金、北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心等的资助。

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来源：清华大学