摘要：D-乳酸作为乳酸的一种旋光异构体，在包装、食品、制药等多个行业有着广泛的应用。比如在食品行业，它能够作为酸味调节剂，赋予食品独特的风味，广泛应用于各类食品的加工。而且，在可生物降解塑料——聚乳酸的生产中，D-乳酸更加不可或缺，当 D-乳酸和 L-乳酸混合时，可
D-乳酸作为乳酸的一种旋光异构体，在包装、食品、制药等多个行业有着广泛的应用。比如在食品行业，它能够作为酸味调节剂，赋予食品独特的风味，广泛应用于各类食品的加工。而且，在可生物降解塑料——聚乳酸的生产中，D-乳酸更加不可或缺，当 D-乳酸和 L-乳酸混合时，可以形成一种特殊的立体复合物结构，从而极大地提升聚合物的热稳定性，这也令 D-乳酸的市场需求日益增长。然而，目前 D-乳酸的产量较低、价格昂贵，开发一种高效的 D-乳酸生产方法迫在眉睫。
近期，来自大阪公立大学化学工程系 Ryosuke Yamada 团队于Biotechnology for Biofuels and Bioproducts发表了一项题为“Enhancing D-lactic acid production by optimizing the expression of D-LDH gene in methylotrophic yeast Komagataella phaffii”的研究，该研究借助Komagataella phaffii（毕赤酵母），成功实现利用甲醇高效生产 D-乳酸，并创造了目前以甲醇为唯一碳源时的最高产量记录。
在这项研究中，科研人员通过优化 D-乳酸脱氢酶（D-LDH）基因在毕赤酵母中的表达，来实现从甲醇高效生产 D-乳酸的目标。他们首先利用 5 种不同来源的 D-LDH 基因（分别来自德氏乳杆菌 Lactobacillus delbrueckii、肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides、乳酸明串珠菌 Leuconostoc lactis、假肠膜明串珠菌 Leuconostoc pseudomesenteroides 和芽孢乳杆菌属 Sporolactobacillus laevolacticus）和 8 种启动子（包括 4 种甲醇诱导型启动子和 4 种组成型启动子）构建了一系列质粒。在将其成功转化到毕赤酵母 GS115 菌株中后，研究人员分析了 5 种不同微生物来源 D-LDH 的工程菌株的生长态势、代谢物水平以及 D-LDH 的活性。其中，表达 LlDLDH（德氏乳杆菌）和 LpDLDH（假肠膜明串珠菌）基因的菌株展现出明显的产量优势，产生的 D-乳酸浓度远高于表达传统 LmDLDH 基因的菌株。
图|在 pAOX1 启动子控制下，5 种不同微生物来源 D-LDH 的工程菌株的 D-乳酸产量
随后，研究人员进一步深入探究不同启动子对 LlDLDH 表达的影响。最终发现，在 8 种不同启动子的调控下，pCAT1 和 pFLD1 这两种启动子在促进 D-乳酸产生方面表现尤为出色。
基于以上结果，研究人员构建了携带 LlDLDH 基因和 pCAT1 或 pFLD1 启动子的多拷贝整合质粒，并再次转化到毕赤酵母 GS115 中。经过多轮筛选和基因扩增，成功获得了一系列工程菌株。
随后，研究人员对这些具有高产潜力的菌株进行转化后基因扩增，并再次筛选。实现数据表明，在一定抗生素 zeocin 浓度下对工程菌株进行基因扩增后，能够显著提高 D-乳酸的产量。而且，其中的 GS115_CFL/Z3/04 菌株表现更是脱颖而出，在培养 120 小时后，D-乳酸产量达到了 5.18g/L，创造了目前以甲醇为唯一碳源时的最高产量记录！
图|转化后基因扩增菌株的摇瓶中，不同菌株甲醇浓度、D - 乳酸产量
通过优化基因和启动子的组合、合理运用多个启动子、将基因精准整合到 rDNA 位点以及进行转化后基因扩增等一系列技术手段，该研究显著的提高了微生物生产目标产物的效率，也为传统 D-乳酸的化学生产提供了一个可行的、环保的替代方案。相信未来，随着该技术的进一步推广，有望实现 D-乳酸的高效、稳定、大规模的工业生产。
参考链接：
1. Inoue, Y., Yamada, R., Matsumoto, T. et al. Enhancing D-lactic acid production by optimizing the expression of D-LDH gene in methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Biotechnol Biofuels 17, 149 (2024). https://doi.org/10.1186/s13068-024-02596-0
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来源：生辉SciPhi