摘要：鬼笔环肽是一种来自毒鹅膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能够特异性且高亲和力（解离常数Kd为20 nM）地结合到聚合态肌动蛋白（F-肌动蛋白）上。鬼笔环肽可将肌动蛋白聚合的临界浓度降低至不到1 µg/ml，从而作为聚合增强剂发挥作用。鬼笔
鬼笔环肽是一种来自毒鹅膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能够特异性且高亲和力（解离常数Kd为20 nM）地结合到聚合态肌动蛋白（F-肌动蛋白）上。鬼笔环肽可将肌动蛋白聚合的临界浓度降低至不到1 µg/ml，从而作为聚合增强剂发挥作用。鬼笔环肽已被四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（1）标记，广泛用于替代肌动蛋白抗体，特异性地标记组织培养细胞和组织切片（2，见图1）以及无细胞体系中的肌动蛋白丝。罗丹明标记的鬼笔环肽肌动蛋白丝保留了许多未标记肌动蛋白的功能特性，包括其与肌球蛋白相互作用的能力。
艾美捷罗丹明标记鬼笔环肽(14uM甲醇)#PHDR1：
材料：罗丹明鬼笔环肽以粉红色固体形式提供，分子量为1306。1×工作液的PHDR1足以对300-350个盖玻片（22×22 mm）上的细胞进行染色（图1）。
注意：鬼笔环肽有毒，必须小心处理（人LD50 = 2 mg/Kg）。
储存与复溶：- 室温运输。短暂离心以将产品收集到试管底部。用500 µL 100%甲醇复溶，制备14 µM溶液。建议将溶液分装成10份×50 µL，置于-20°C避光保存，可稳定保存6个月。冻干产品在4°C干燥（
免疫荧光应用方案：
用于组织培养细胞中肌动蛋白丝的荧光染色有多种方法。固定程序对于获得细胞内F-肌动蛋白分布的真实表现至关重要。应根据实验要求选择固定方法。用甲醛或戊二醛固定组织培养细胞，可获得良好的肌动蛋白丝染色效果和片状伪足的保存效果。
试剂：
1. 罗丹明鬼笔环肽（货号PHDR1）
2. 在玻璃盖玻片上生长至半融合状态的瑞士3T3细胞
3. 可以从Cytoskeleton, Inc.获取F-肌动蛋白染色试剂盒（货号BK005），或者自行准备以下4至7号试剂
4. 磷酸盐缓冲液（PBS，50 mM磷酸钾，pH 7.4，50 mM NaCl）
5. 固定液（PBS中的4%甲醛，需要将pH调至7.0）
6. 通透缓冲液（PBS中的0.5% Triton X-100）
7. 抗淬灭封固介质（Fluka BioChemika，货号10981）
8. PBS中的100 nM DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）
9. 玻璃载玻片（25×75×1 mm）
10. 封固盖玻片的溶液（透明指甲油）
图1：瑞士3T3细胞中的肌动蛋白应力纤维
图例：瑞士3T3细胞在玻璃盖玻片上生长至半融合状态，并按方法描述用罗丹明鬼笔环肽固定和染色。细胞在配备数字CCD相机和100×物镜的荧光显微镜下观察。注意细胞中广泛分布的肌动蛋白应力纤维（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。
设备：
1. 荧光显微镜，配备罗丹明的激发滤光片（535±20 nm）和发射滤光片（585±20 nm），以及DAPI的激发滤光片（355±20 nm）和发射滤光片（460±20 nm）。
2. 数字CCD相机。
方法：
1. 在玻璃盖玻片上培养组织培养细胞，直至半融合。
2. 通过将3.5 µL 14 µM标记的罗丹明鬼笔环肽储备液稀释到500 µL PBS中，制备100 nM的工作液。在室温下避光保存。
3. 移去培养基，用37°C的PBS轻轻洗涤细胞一次。
4. 在室温下用固定液固定细胞10分钟。
5. 在室温下用PBS洗涤细胞一次，持续30秒。
6. 在室温下用通透缓冲液通透细胞5分钟。
7. 在室温下用PBS洗涤细胞一次，持续30秒。
8. 将盖玻片移至湿盒中的蜡纸上，加入200 µL 100 nM罗丹明鬼笔环肽。在室温下避光孵育30分钟。
9. 用PBS洗涤盖玻片三次。
10. 用200 µL 100 nM DAPI在PBS中复染DNA 30秒。
11. 用PBS冲洗盖玻片，并将其倒置在玻璃载玻片上的抗淬灭封固介质滴上。用纸巾轻轻擦去多余介质，并用指甲油密封四周。
12. 将载玻片置于4°C避光保存。
13. 典型的F-肌动蛋白染色结果见图1。
来源：小王讲科学
