摘要：关键步骤：在所有配方中，酸(1,2,4-丁三羧酸和马来酸酐)与1,8-辛二醇的摩尔组成保持在1:1的比例，而加料摩尔比为1,2,4-丁三羧酸与马来酸酐的比例可以改变(2:8、4:6或6:4)，以调整聚合物链的分支，以达到理想的刚度和机械性能，这些性能落在要建模

文章介绍

题目：A well plate–based multiplexed platform for incorporation of organoids into an organ-on-a-chip system with a perfusable vasculature

杂志：Nature Protocols

影响因子：IF:14.8

发表时间：2021年3月31日

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具体步骤：

1,2,4预聚液的化学合成及UV光交联聚合物溶液的制备

● 时间：2天

（1）1,2,4预聚物液体的合成（步骤1-11)。根据表1中的配方称量每一种单体。

表1

关键步骤：在所有配方中，酸(1,2,4-丁三羧酸和马来酸酐)与1,8-辛二醇的摩尔组成保持在1:1的比例，而加料摩尔比为1,2,4-丁三羧酸与马来酸酐的比例可以改变(2:8、4:6或6:4)，以调整聚合物链的分支，以达到理想的刚度和机械性能，这些性能落在要建模的组织的范围内。

关键步骤：线性聚合物链之间的交联赋予了材料的弹性性能。因此，不均匀的羧酸和酸酐的摩尔组成允许分支和UV交联的线性聚合物链，以实现所需的弹性。预聚物通常以15-25 g的批量制备。在此范围之外，可能需要进一步优化反应时间和条件，以获得聚合物交联时间和机械性能的理想结果。

（2）建立如图2a所示的缩聚布置。缩聚反应发生在三颈圆底烧瓶中，悬浮在热板磁力搅拌器上的加热油浴中。热板有一个外部温度探头，放置在油浴中调节温度到160°C。从反应容器排出的出口气体经水冷凝器收集水副产物，最后经充水烧杯起泡捕获剩余的微量液体副产物。

图2 1,2,4预聚物的合成、设置及评价。a、缩聚和净化装置示意图。b、代表1,2,4预聚物的氢核磁共振谱。c、以2:3单体配方(1,2,4-丁三羧酸/1,8-辛二醇)制备的1,2,4预聚物的力学应力-应变曲线。

（3）在三颈烧瓶中混合步骤1中的单体。在烧瓶上添加一个磁性搅拌棒，在没有贴在出口玻璃器皿上的颈部添加橡胶塞（取决于烧瓶类型），并添加氮气入口线。

（4）将反应容器浸泡在预热到160℃的油浴中熔化单体。

（5）一旦单体熔化并混合，将温度降至150℃，在氮气吹扫下反应3-5小时（图2a）。

关键步骤：用铝箔盖住缩聚装置，防止反应物质受到光的照射。

（6）一旦聚合完成，就会形成一种粘性液体。从油浴中取出反应容器，将其从出口玻璃器皿（即冷凝器和收集瓶）上分离，并让1,2,4预聚合物液体冷却。

（7）将冷却的1,2,4预聚体液体溶解在~25 mL的1,4-二恶烷中，开始纯化过程，以去除低聚物或未反应的单体。

（8）将1,4-二恶烷溶解的1,2,4预聚合物液体倒入分离漏斗中进行进一步的聚合物纯化。将聚合物溶液缓慢滴入去离子水（~1L）烧杯中（图2a）。

（9）一旦聚合物溶液的滴入沉淀完成，聚合物溶液就会积聚在烧杯的底部。慢慢地小心地倒入液体溶液，尽可能多地去除，然后将聚合物层收集在一个玻璃闪烁小瓶中。

（10）将收集的预聚物在气流下干燥48小时。

（11）所得纯化的预聚物是一种相对透明的粘性溶液。溶液应保存在黑暗中，直到准备用于生成UV交联支架。

暂停点：氢核磁共振（图2b）和应力-应变曲线（图2c）是常规对1,2,4预聚液进行的两种分析，用于质量保证目的，以确保进行缩聚步骤。

（12）制备可紫外交联的1,2,4预聚物溶液（步骤 12-16）。将5克纯化的1,2,4预聚物与PEGDM混合，按 6:4 的比例（1,2,4预聚物/PEGDM）装入闪烁玻璃瓶中。用刮刀将试剂充分混合。

（13）将0.05 g Iragcure 2959（终浓度为总质量的5% wt）加入1,2,4预聚物-PEGDM混合物的玻璃瓶中。

（14）将Iragcure 2959溶解在聚合物混合物中，用刮刀在120°C加热板上搅拌。

关键步骤：Iragcure 2959需要完全溶解，直到看不到小颗粒。避免长时间加热试剂超过120°C，以防止1,2,4预聚物通过缩聚而发生不希望的交联。在预聚物混合物中不需要其他溶剂溶解。

（15）将充分混合的1,2,4预聚物-PEGDM-UV引发剂试剂倒入装有20号针头的10毫升注射器中。

（16）用彩色标签胶带盖住注射器，避光并保存在4°C直到使用。

暂停点：1,2,4预聚物-PEGDM-UV引发剂在黑暗中稳定1个月。使用前将溶液在室温（20-25℃）下加热。

AngioTube支架和96孔基板母模的微细加工

● 时间：2天

（17）使用所提供的AutoCAD掩模制备了AngioTube支架顶层和底层设计的SU-8主模以及96孔底板的主模。光掩膜可以使用掩膜作家或通过外包（建议dpi: 20,000）打印。所有的光罩都设计成适合6英寸的硅片。

（18）用脉冲氮气清洁6英寸硅片表面。

关键步骤：步骤18-41应在洁净室设施内进行，以避免粉尘沉积（图3）。

图3 利用光刻胶和软光刻技术对血管管支架和基板的主模具进行微细加工。a、在硅片(黑色)上制备主模种子层(绿色)，方法是旋转涂覆一层15 µm的SU-8 25，并在干净的硅片上紫外曝光交联基片。b、微加工SU-8主模具，用于血管支架或基板设计。不同特征的主模具的血管支架和基板设计需要不同次数的旋涂光刻胶(墨绿色)和紫外线曝光。c、用SU-8显影剂开发多层母模，缓摇30分钟。

（19）将硅片置于旋转镀膜机的中心，并施加真空。

（20）将~10 mL的SU-8 25涂抹在硅片上，作为种子层，更好地控制特征厚度。

（21）在以下条件下旋转晶圆片以产生25 µm的层厚：初始旋转速度为500 rpm，持续5 s，以200 rpm/s加速，并以2,000 rpm保持30 s。

（22）将晶圆片转移到65°C的热板上3分钟，然后在95°C的温度下烘烤7分钟。

（23）将晶圆片从热板中取出，在室温下冷却1分钟。

（24）使用OAI 30型紫外线掩膜对准器，在 400 mJ/cm2的紫外线下照射晶圆30秒。

（25）将暴露的晶圆片转移到65°C的热板上1分钟，然后在90°C下烘烤4分钟。

（26）将带有种子层的硅片置于旋转镀膜机的中心。

（27）在含有种子层的晶圆片上涂抹~10 mL SU-8 2050，制备特征层1 （L1）。

（28）在以下条件下旋转晶圆以构建50 µm厚的L1：初始旋转为500 RPM持续5秒，在300 RPM/s加速，在3000 RPM保持30秒。

（29）将晶片转移到65°C的热板上3分钟，然后在95°C的热板上10分钟。

（30）将晶圆片从热板中取出，在室温下冷却。

（31）按照制造商的说明将晶圆片放置在EVG620 UV掩膜校准器上。

（32）用2-丙醇清洗底层的AngioTube光罩L1，用脉冲氮气干燥。

（33）将L1光掩膜放在玻璃基板上，然后将L1光掩膜装载到EVG620 UV光罩对准器。

（34）使用EVG620 UV掩模校准器提供的“真空+硬接触”程序，使掩模和晶圆片保持保形接触。

（35）将晶片暴露在170 mJ/cm2的紫外线下。

关键步骤：调节程序曝光剂量1.5倍，因为光掩膜是在玻璃基板上。

（36）在65°C下烘烤1分钟，在95°C下烘烤6分钟，然后在室温下冷却晶片。

（37）重复第27-36步，制备第2层（L2）和第3层（L3），以生成血管管支架的底部特征。L2，构建一个90 µm侧壁中空腔通道与SU-8 2050保持1900 rpm（步骤28），初始烘焙95°C 15 min（步骤29），暴露晶片屏蔽L2紫外线剂量340/ms（步骤35）和曝光后烘焙95°C 10 min（步骤36）。对于L3，使用SU-8 2025 （步骤27）保持4500 rpm（步骤28)，初始烘烤8 min 95°C（步骤29)，晶片紫外线剂量150 mJ/s（步骤35)，35 min 95°C（步骤36）。

关键步骤：L2和L3必须与前一层完美对齐，以形成血管支架或96孔底板模具的图案特征。用户应在每个光掩模上使用提供的对准标记（即十字）进行对准指导。

（38）根据步骤18-37准备新的晶圆片，并按照步骤27-36制作AngioTube支架的一层顶部特征或96孔底板的两层主模具。使用6英寸的硅片。为了生成AngioTube支架的顶部特征，用SU-8 2050覆盖晶圆片（步骤27），保持1700 rpm（步骤28），在95°C下初始烘烤15分钟，在紫外线剂量230 mJ/s下将晶圆片暴露在顶层的光掩膜上（步骤35），并在95°C下烘烤10分钟（步骤36）。96孔基板的主模具，使用基层1构建150 µm的微柱，将AngioTube支架从基板底部抬起。为了生成基层1，用SU-8 2150覆盖晶圆片（步骤27），保持在2900 rpm（步骤28），95°C初始烘烤20分钟（步骤29），将晶圆片暴露在光掩膜基层1上，紫外线剂量为260 mJ/s（步骤35），曝光后在95°C烘烤10分钟（步骤36）。基层2用于构建沟槽以形成图案壁，以很好地容纳组织中凝胶包被的实质细胞。对于基层2，用SU-8 2150覆盖曝光的晶圆片（步骤27），保持在1200 rpm（步骤28），在95°C下初始烘烤25分钟（步骤29），将晶圆片暴露在光掩膜基层2上，紫外线剂量为370 mJ/s（步骤35），曝光后在95°C下烘烤5分钟（步骤36）。

关键步骤：基层2必须与前一层完美对齐，形成96孔基板模具的图案特征。用户应使用提供的对齐标记（即十字）在每个光掩模上用于对准指导。

（39）将步骤37中AngioTube支架模具底部特征的三层外露晶片、步骤38中AngioTube支架模具顶部特征的一层晶片或96孔底板模具的两层晶片浸泡在SU-8显影剂中，慢摇30分钟。

（40）从显影液中取出晶片，用2-丙醇喷雾去除未显影的光刻胶。

（41）用胶带将开发和干燥的SU-8硅母模单独固定在方形聚苯乙烯生物测定皿的底部，以便在未来的步骤中使用。

组装AngioTube支架，压花96孔底板，制造InVADE平台

● 时间：2-3天

（42）制备AngioTube支架PDMS阴性模板和96孔基板（图4a）（步骤42-45）。在一次性混合容器中混合~300 g PDMS（按10份有机硅弹性体基料与1份固化剂的重量比），用于制造AngioTube支架上下特征的SU-8硅母模。同时，将~300 g PDMS在一次性搅拌容器中混合（硅胶弹性体基料5份：固化剂1份），用于96孔底板的SU-8母模。

图4 三维冲压技术制备血管支架。a、最左边，通过将PDMS预聚合物浇铸到SU8主模具上，开发血管管支架和基板设计的不同部分的PDMS阴性模板。中间偏左，将混合良好的PDMS预聚物脱气，并允许PDMS预聚物在水平表面上成型48小时以上。最右边，检索PDMS阴性模板。b、顶部，最左边，用PDMS(AngioTube的顶部设计)或覆盖玻璃(AngioTube的底部设计)盖住PDMS阴性模板，并注入1,2,4预聚物(与40%PEGDM混合)来塑造PDMS阴性模板的通道。成型可以通过在通道入口滴入一滴预聚体混合物来实现。正压将预聚合物混合物灌注到PDMS负模板中。最上面，最右边，将预聚物混合物暴露在洁净室设施的紫外线下，以引发预聚物交联。底部，最左边，组装完整的AngioTube支架，将顶部设计与底部设计对齐，并将它们冲压在一起。底部，最右边，将冲压好的血管管支架暴露在紫外线下，以启动两部分的结合。用PBS浸泡一夜，或用剃须刀片小心地将组装好的血管管支架从覆盖玻璃上释放出来。c、血管支架的扫描电镜图，有100µm的管腔通道和15µm的侧壁微孔。

（43）倒入300克PDMS混合物，均匀分布，覆盖在设计的微特征上SU-8主模具从步骤41。

（44）将覆盖PDMS的SU-8母模放入真空干燥器中1小时，在

（45）从真空装置中取出PDMS铸造的SU-8主模，并保持PDMS在高温(~100°C)下固化2小时或室温下固化2天的水平表面。

（46）装配血管管支架与3D冲压（步骤46-61）。用手术刀从SU-8主模上切下血管支架上下特征的全固化PDMS模板。

关键步骤：从主模上取下PDMS模板时要小心，以免损坏PDMS模板或SU-8主模上的特征。

（47）用透明胶带清洁两个PDMS模板的特征面，以去除沉积的灰尘颗粒。

（48）修剪~1毫米的两端PDMS模板暴露的入口和出口通道。

（49）在未经任何等离子处理的情况下，用方形玻璃载玻片盖住血管支架底部PDMS模板的特征侧。

（50）在AngioTube支架顶部的PDMS模板的特征侧盖上一块扁平的无尘PDMS片（由10份有机硅弹性体基材和1份固化剂制成）。

（51）通过在PDMS模板的入口滴入一滴(~0.1 g)，将步骤16中的UV交联1,2,4预聚物溶液注入到有盖的PDMS模板中。

关键步骤 步骤51-56应在洁净室设施内进行，以避免灰尘沉积在AngioTube微通道和微孔上（图4b-c）。

暂停点：预聚体溶液将通过毛细管作用在一夜之间填充和塑造PDMS模板的特征。将注塑成型的PDMS模板存放于避光处。

（52）将1,2,4预聚模PDMS模板暴露在OAI 30型掩模对准器下的紫外线下，曝光能量约为3,000 mJ。

关键步骤：必须对每批1,2,4预聚物的紫外曝光时间进行微调。避免使用过高的紫外线照射剂量，因为它会导致1,2,4预聚物的过度交联，并影响在3D冲压两个特征层后AngioTube支架顶部和底部特征的结合。

（53）打开玻璃片上的PDMS模板，暴露出血管管的光交联1,2,4聚合物底部特征。光交联聚合物应留在玻片上。

关键步骤：预聚物的过度交联将导致1,2,4聚合物支架被PDMS模板捕获并从玻片上分离。

（54）从PDMS平板上打开PDMS模板，暴露出血管管的光交联1,2,4聚合物顶部特征。光交联聚合物应保持在血管管支架顶部的PDMS模板上。

关键步骤：预聚物的欠交联将导致光交联1,2,4聚合物的顶部特征不充分地转移到PDMS平板上。

（55）在可控制x、y和z轴的对准台上，用直立显微镜将带有顶部1,2,4特征图案聚合物的PDMS平板对准并压印在带有底部1,2,4特征图案聚合物的玻璃载玻片上。

关键步骤：这应该在最终冲压特征之前进行多次检查。

（56）以5000兆焦耳的暴露能量照射额外的紫外线，使血管支架的顶部和底部特征结合在一起。

关键步骤：这两个特征之间的键合是通过1,2,4预聚物的额外自由基聚合实现的。

（57）用细尖镊子慢慢地取出PDMS平板。组装后的血管支架的两层特征层应紧密结合并牢固地附着在玻片上。

（58）将组装好的1,2,4聚合物AngioTube支架转移到80°C的烤箱中，并孵育一夜，以增强两层特征层之间的结合。

关键步骤：避免长时间的支架烘烤，以尽量减少整体刚度的增加。

（59）将PBS浸入玻璃载玻片中，用刀片将支架从玻璃载玻片上慢慢刮去，恢复组装好的血管管支架。

（60）用70% (vol/vol)乙醇孵育AngioTube支架过夜，使用前用PBS清洗支架三次。

关键步骤：这将浸出聚乙二醇dm，在血管管支架的侧壁上产生纳米孔隙，并洗掉剩余的紫外线引发剂。

（61）将血管支架在4°C的PBS中保存在密封容器中直至使用。

暂停点：3D打印的血管管支架将耐用长达6个月。

（62）用PDMS模板作为冲压模具，通过热压系统制备聚苯乙烯96孔基板（步骤62-71）。用手术刀从步骤45中96孔底板的SU-8主模具上切下完全固化的PDMS模板，并用剃须刀片修剪模板上多余的PDMS。

关键步骤：从主模上取下PDMS模板时要小心，以免损坏PDMS模板或SU-8主模上的特征。

（63）用透明胶带清洁PDMS模板的非特征面，清除灰尘。

（64）通过手持式电晕处理3分钟，通过等离子体功能化表面，将96孔基板特征的PDMS模板粘合到干净的硅片上。PDMS模板的非特征面表面应进行处理。

关键步骤：为了使表面处理均匀，应采用清扫运动。

（65）将96孔底板的PDMS片粘接模板放入80℃烘箱中，使两表面不可逆粘接。

（66）将96孔底板粘接的PDMS模具从烤箱中取出，在室温下冷却10分钟。

关键步骤：步骤66-70应在洁净室设施内进行（图5a）。

图5 InVADE平台的组装。ai、基板设计的PDMS模板粘合到硅片上进行热压花的摄影图像。aii、EVG520热压机热压成型底板设计到聚苯乙烯板的照片。b、InVADE平台组装所需组件的摄影图像，包括在定制的图案聚苯乙烯底座上对齐的AngioTube支架、镊子、无底井板、聚氨酯胶浇注系统和玻璃片。c、InVADE平台组件示意图。

（67）用手术刀切一个矩形聚苯乙烯片（12厘米宽×9厘米长）。

（68）去除表面保护膜，将聚苯乙烯片材对准PDMS模具的特征侧。用一个1公斤重的金属圆盘夹住聚苯乙烯板和PDMS模具。

（69）将该组件放置在EVG520热压系统上，并以180°C的最终温度和7,000-N的力运行成型程序7分钟。

关键步骤：不要施加过大的力，因为这可能导致聚苯乙烯基板上的微特征通道分层。

（70）拆卸组件并冷却1分钟，然后取出成型的聚苯乙烯基板。

（71）从成型的聚苯乙烯基板上修剪多余的聚苯乙烯，以匹配无底96孔板的尺寸。

（72）在96孔图案聚苯乙烯基板上制造带有血管管支架的InVADE平台（图5b-c）（步骤72-83）。将热压图案聚苯乙烯基板（步骤71）置于立体显微镜下。

（73）将~50 µL培养基分别应用于聚苯乙烯基板上的组织腔。放置并对齐AnigoTube支架（步骤61）在聚苯乙烯基板横跨组织室使用细尖镊子。在血管管支架进出口对齐的聚苯乙烯基板上绘制特定尺寸的沟槽。

关键步骤：培养基将减少PBS浸泡的血管支架的肿胀，血管支架应在有图案的组织腔内完美排列，该组织腔与聚苯乙烯基板上的进出口孔相连。

（74）用金纸巾的尖端除去血管管支架周围多余的培养基。

（75）将所有20个AngioTube支架放置在聚苯乙烯基板上各自的组织腔上后，从胶水浇注系统中以1:1的体积比分散4,4'亚甲基二环己基二异氰酸酯（A部分）和聚酯多元醇（B部分），在50毫升锥形管中制备10毫升聚氨酯胶水。用木棒充分混合。

关键步骤：以均匀的比例浇铸这两种成分并充分混合是很重要的。如果混合不当，聚氨酯胶粘剂将无法将图案聚苯乙烯基充分粘合到无底板上。

（76）室温下200 g聚氨酯胶离心3 min，使分散在锥形管壁上的组分沉淀。

（77）用金刚石刀将一块玻璃片切成长方形（12.5厘米宽×9.5厘米长)。

（78）涂抹混合好的聚氨酯胶，使其均匀覆盖在玻璃板上。

（79）将涂有聚氨酯胶的玻璃片贴在96孔无底板基侧5秒后，将玻璃片从96孔无底板基侧取下。

关键步骤：聚氨酯胶应在96孔无底板基侧的整个网格上提供一层薄涂层（

（80）将聚苯乙烯基板与放置的AngioTube支架对齐到96孔无底板上。

关键步骤：这应该小心进行，以避免聚氨酯胶泄漏到血管管支架的管腔通道中。

（81）用活页夹将聚苯乙烯底座固定在无底板上。

（82）将组装好的聚苯乙烯底座/无底板放入80°C的烤箱中过夜，以增强聚氨酯胶的固化过程。

（83）从完成的InVADE平台上取下活页夹。

暂停点：该平台可在室温下保存直至使用。

在InVADE平台上工程3D血管化功能组织，用于药物筛选

● 时间：10天

（84）准备细胞培养的InVADE平台（图6a）（步骤84-89）。使用3毫米外科打孔器去除血管管支架进出口孔中多余的1,2,4聚合物末端。这将打开血管支架的管腔通道。

图6 血管化和实质组织在血管支架周围的播散。a、在重力驱动灌注下，用0.2% (wt/vol)明胶涂敷2小时，用内皮细胞生长培养基灌注过夜，制备血管管支架的管腔通道。b、内皮细胞(EC)在血管管支架中的播种。制备浓缩EC悬液，从支架进出口分别加入4-5 µl悬液。压力差驱动EC悬液到AngioTube支架的中间段(时间0分钟)。在37℃下孵育2小时，使内皮细胞附着在血管管支架的管腔上。使用带压力头梯度的EGM2培养基冲洗未附着的内皮细胞(时间为2小时)。c、在时间0时捕获集中的内皮细胞移动到AngioTube生物支架中间，2小时后捕获内皮细胞附着的亮场图像。d、实质细胞在血管化的血管管支架周围播种。单细胞(心肌细胞、肝细胞或癌细胞(红色)在纤维蛋白水凝胶(粉红色)中预混。在移液管尖端形成单个细胞-水凝胶混合物，并直接添加到血管管支架的顶部。允许10分钟的凝胶化(37°C)在AngioTube支架周围。施加有压力梯度的培养基开始灌注。进口和出口孔含有EGM2培养基，组织室含有用于培养感兴趣组织的培养基。e、在5天的培养过程中捕捉心脏组织压实的亮场图像。

（85）在每个孔中加入70%（vol/vol）乙醇，并用无菌聚苯乙烯微孔板盖住平台，对InVADE平台进行灭菌。室温孵育1小时。

关键步骤：组装式InVADE平台的伽马灭菌（剂量30 Gray）可作为替代灭菌方法。

（86）抽吸70%（vol/vol）的乙醇，在无菌条件下让InVADE平台风干30分钟。

（87）在AngioTube支架的进口孔、组织孔和出口孔各加500 µL PBS 30分钟。

关键步骤：乙醇引起1,2,4聚合物的肿胀，并可能导致组织腔内血管支架的移位。PBS会把支架缩回原位。

（88）抽吸PBS，然后在进孔中加入500 µL无菌0.2%明胶溶液，在组织孔中加入300 µL 0.2%明胶溶液，在出口孔中加入20 µL 0.2%明胶溶液，进行重力驱动流灌注。在37°C培养箱中涂覆管腔聚合物表面2小时。

关键步骤：明胶涂层将促进内皮细胞附着。

关键步骤：或者，在进孔中加入500 µL 0.2%明胶溶液，并在InVADE平台离心，驱动明胶溶液灌注到组织和出孔中。

（89）用EGM-2培养基替换0.2%明胶溶液，将InVADE平台置于37°C培养箱中，为细胞播种准备血管支架。

（90）血管管支架腔在InVADE平台上的内皮化（图6b-c）（步骤90-99）。在EGM-2培养基中制备浓缩内皮细胞悬液（25×10^6个细胞/ml）。总共需要8-10 µL的浓缩内皮细胞悬液来覆盖一个AngioTube支架。

（91）从进口和出口井中完全去除起始EGM-2培养基。

关键步骤：当吸入起始EGM-2培养基时，不要让组织中的血管支架充分干燥。

（92）从AngioTube支架的进孔和出孔分别灌注4-5 µL浓缩内皮细胞悬液。细胞悬浮液将流入血管管支架的中间（图6c）。

关键步骤：如果血管支架两端的压头较高，则浓缩的内皮细胞悬浮液会向压头较低的一端灌注。因此，从进口和出口井中清除所有过量的EGM-2培养基是很重要的。

（93）在没有血管管支架的InVADE平台的孔中加入多余的PBS。这避免了使浓缩的内皮细胞悬浮液干燥。

（94）将InVADE平台转移到37°C和5%CO2的静态条件下培养2小时，以允许内皮细胞附着。

关键步骤：当InVADE平台位于培养箱内时，应处于水平位置。

（95）从进出孔的血管管支架端抽吸未附着的浓缩内皮细胞悬液。从其他非支架井中除去多余的PBS。

（96）在进孔中加入500 µL EGM-2培养基，在组织室中加入300 µL EGM-2培养基，在出孔中加入20 µL EGM-2培养基，在AngioTube支架管腔中启动重力驱动灌注。

（97）通过在血管支架两端的入口和出口孔连续移液，从血管支架的管腔中去除未粘附的内皮细胞。

关键步骤：为了增加冲洗，InVADE平台还可以倾斜45°。在明视野显微镜下检查，确保未粘附的内皮细胞从AngioTube支架的管腔流出并进入出口孔（图6c）。

（98）将InVADE平台放在带有倾斜台的自动摇摆装置上，置于37°C和5%CO2的培养箱中。设置摇摆程序3小时，以交替倾斜阶段的位置，以在InVADE平台内产生连续的流动。

（99）允许内皮细胞在持续灌注下增殖。培养2-3天后可形成融合的内皮细胞层。内皮培养基应每天更换，以形成融合的血管网络。

（100）在InVADE平台上培养实质组织（图6d-e）（步骤100-107）。准备一个悬浮的浓缩实质细胞悬浮液，取决于感兴趣的组织。将感兴趣的细胞与水凝胶ECM混合在冰上消毒的锥形管中：

● 肝癌或乳腺癌组织：150×10^6个细胞/ml，纤维蛋白原（33 mg/ml）溶液；

● 心脏组织：100×10^6个细胞/ml，纤维蛋白原（33 mg/ml）溶液；

● 患者胰腺类器官：1.75×10^6个细胞/ml，生长因子减少的Matrigel溶液。

关键步骤：在长型血管管支架上培养肝癌或乳腺癌组织总共需要100万个肝细胞或癌细胞。在悬臂式血管管支架上培养心脏组织总共需要25万个干细胞来源的心肌细胞。在长型血管管支架上培养患者胰腺类类器官总共需要14000个患者单细胞。

（101）在将细胞凝胶混合物播种到InVADE平台上的AngioTube支架上之前，将EGM-2培养基完全从组织腔室中抽吸出来。

关键步骤：组织腔室中残留的EGM-2培养基会影响细胞-凝胶混合物的凝胶化。在InVADE平台的进出口孔中保持相同的压头（100 µL EGM-2培养基），以避免AngioTube支架内的流动停止。

（102）准备实质组织。

● 为了在长版AngioTube支架上种植实质组织，取7 µL细胞凝胶混合物（150×10^6个细胞/ml），在冰冷的无菌微离心管中与2 µL凝血酶溶液混合。通过移液三次彻底混合。

● 为了在AngioTube支架的悬臂版本上种植实质组织，取3.5 µL细胞凝胶混合物（100×10^6/ml），在冰冷的无菌微离心管中与1 µL凝血酶溶液混合。通过移液三次彻底混合。

关键步骤：当细胞凝胶混合物与凝血酶混合时，避免产生气泡。

关键步骤：凝血酶终浓度为5.5 IU/ml（原液浓度为25 IU/ml）。这个浓度保证了在播种实质组织时纤维蛋白原的快速凝胶化。

（103）在实质组织中播种。

● 在长型血管支架上播种实质组织，取7 µL组织播种悬浮液，在移液管尖端形成液滴，直接滴到血管支架上。

● 在悬臂式支架上播种实质组织，将2 µL组织播种悬浮液移液管，在移液管尖端形成液滴，直接滴到血管支架上。

关键步骤：较高的细胞密度可能导致细胞从组织腔室的图案壁溢出。较低的细胞密度可能影响活体细胞-细胞接触组织和组织功能输出。

（104）将InVADE平台置于37°C和5%CO2培养箱中10分钟以达到凝胶化。

（105）凝胶化后，重新启动重力驱动流。在进孔中加入500 µL EGM-2培养基，在出孔中加入20 µL EGM-2培养基。在InVADE平台的组织室中加入300 µL相应的实质组织培养基。

（106）将InVADE平台放在带有倾斜台的自动摇摆装置上，置于37°C和5%CO2的培养箱中。设置摇摆程序3小时，以交替倾斜阶段的位置，以在InVADE平台内产生连续的流动。

（107）每隔1-2天更换一次InVADE平台中的培养基，以维持血管化的3D组织的功能。

功能组织分析

（108）根据组织模型，可以进行几种功能分析以捕获所需的生理现象。功能组织分析通常在将实质细胞植入InVADE平台后的第7天或第8天进行（步骤103）。其中一些检测在以下方法中被强调为可选步骤。研究心脏组织的药物诱导反应，采用方案B。分析肝组织的尿素分泌，采用方案C。在InVADE平台上跟踪癌细胞外渗和内渗，采用方案D。研究癌细胞对间质微环境的重塑，采用方案E。

(A) 血管灌注及通透性评估（定量或定性）

● 时间：1天

(i) 在EGM2培养基中制备与TRITC分子结合的葡聚糖(70 kDa, 10 µM)，从InVADE平台的进孔中灌注500 µL溶液过夜(~18 h)。InVADE平台的组织室和出孔中分别仅含有300 µL和20 µL EGM2。

(ii) 收集所有孔和室中后续灌注的培养基，用荧光分光光度计在557 nm的激发(ex)和576 nm的发射(em)下测量TRITC的浓度。

关键步骤：将渗透荧光分子的浓度与tritc-葡聚糖标准曲线的浓度进行比较。

(iii) 在PBS中制备与TRITC分子(70 kDa, 10 µM)或CFDA分子(~556 Da, 10 µM)偶联的葡聚糖，从InVADE平台的进孔中灌注500 µL溶液。InVADE平台的组织室和出口孔分别只含300 µL和20 µL PBS。

(iv) 在荧光显微镜下，tritc-共轭右旋糖酐和CFDA分子分别在ex 557/em 576 nm和ex 492/em 517 nm下捕捉大分子和小分子扩散到活组织腔室的延时图像。延时图像应每15分钟捕获一次，持续3小时。

(B) 心脏组织药物诱导反应的研究

● 时间：1天

(i) 用37℃培养箱固定的荧光显微镜，在蓝色荧光通道下记录组织通过内置悬臂位移自发收缩的基线作为视频。

关键步骤：过度暴露于荧光通道可能损害心脏组织。

(ii) 在EGM2培养基中配制10 µM肾上腺素，从InVADE平台的进孔中灌注500 µL。自发收缩的心脏组织应保持在其各自的心脏培养基中。

(iii) 肾上腺素应用后，每5分钟在蓝色通道记录心脏组织收缩20秒的视频，持续30分钟。

(iv) 使用ImageJ软件分析悬臂从静止位置到最大振幅的位移，以绘制药物暴露心脏组织相对于时间的收缩频率。

(C) 肝组织尿素分泌分析

● 时间：2天

(i) 按1:1的比例配制10 mM碳酸氢铵和EGM2混合培养基，在InVADE平台上进行肝组织培养第7天，将其施用于组织室。在进孔和出孔中分别加入500 µL和20 µL相应的培养基。

(ii) 48 h后，在微离心管中分别从实质空间（组织室）和维管空间（进、出口孔）收集培养基。

(iii) 将收集的培养基样品在300 g室温下离心5 min，去除细胞碎片。

(iv) 根据制造商的程序，使用QuantiChrom尿素测定试剂盒，测定实质和血管间隙中尿素代谢物的分泌。

(D) 在InVADE平台上追踪癌细胞的外渗和内渗

● 时间：10分钟

(i) 在10 d的灌注培养过程中，在荧光显微镜下跟踪表达gfp的癌细胞在绿色通道下的迁移。在10倍的放大倍数下，可以捕捉到血管空间中表达gfp的细胞覆盖率的每日变化。

(E) 胰腺类器官对肿瘤间质微环境重塑的研究

● 时间：1天

(i) 肿瘤类类器官培养后第8天，用4%多聚甲醛在室温下固定类器官/成纤维细胞共培养组织20分钟。

(ii) 用PBS洗涤固定组织三次（每次10分钟）。

(iii) 在组织室的AngioTube支架的两端做一个小切口，然后用镊子把组织挑出来，从InVADE平台上取出组织。

关键步骤：注意不要损伤固定组织。或者，固定组织的回收可以通过用剃须刀片切割出InVADE平台的组织隔间的底部来完成。

(iv) 二次谐波生成（SHG）激光扫描显微镜下肿瘤基质中新胶原沉积图像。将双光子激光器的激发波长设置为840 nm，在395~405 nm之间产生可探测的SHG信号。

(可选) 血管支架内皮和实质组织免疫染色

● 时间：1-2天

（109）在室温下，以倾斜角度（45°）从进孔中灌注4%多聚甲醛30-60分钟。

（110）从进孔中灌注PBS洗涤固定的内皮细胞和实质组织。洗涤步骤在室温下倾斜20分钟。重复洗涤步骤三次。

（111）在室温下倾斜角度灌注1小时，或在4°C水平表面过夜，从入口井中灌注阻断溶液（10%，wt/vol）。

关键步骤：渗透步骤通常与阻断步骤一起进行，这取决于感兴趣的蛋白质标记。对于表面蛋白标记物（即CD31/ZO-1/VE-Cadherin），不需要渗透。对于心脏或癌症细胞内标记物，用0.05%（vol/vol）Triton X-100渗透组织。对于肝细胞内标记物，用冷甲醇渗透肝组织2分钟。

（112）使用特异性抗体对内皮细胞和组织进行免疫染色。

关键步骤：在室温下，通过重力驱动灌注1小时来应用内皮特异性抗体。

故障排除建议表

参考文献

参考信息

A well plate–based multiplexed platform for incorporation of organoids into an organ-on-a-chip system with a perfusable vasculature.Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):2158-2189. doi: 10.1038/s41596-020-00490-1.PMID: 33790475.

武汉大学口腔医院尚政军团队高分综述：类器官技术如何帮助我们更好地理解口腔健康

来源：培养盒守护者