原创解读 | PPB | 小麦TaCHLIs两个同源等位基因的表达影响了叶绿素的合成

摘要：多倍化或全基因组加倍（WGD）是物种进化的重要驱动力之一，六倍体小麦的进化经历了两次多倍化。在进化过程中，一些基因的等位基因数量或功能冗余作用影响了表型特征。镁螯合酶催化Mg

多倍化或全基因组加倍（WGD）是物种进化的重要驱动力之一，六倍体小麦的进化经历了两次多倍化。在进化过程中，一些基因的等位基因数量或功能冗余作用影响了表型特征。镁螯合酶催化Mg2+插入原卟啉IX，是叶绿素生物发生的重要步骤，包含CHLI、CHLD和CHLH三个亚基。在六倍体小麦中，TaCHLI基因的突变会影响叶绿素合成，但具体机制尚不清楚。

近日，Plant Physiology and Biochemistry发表了题为“Two homoeoallelic gene expression ofTaCHLIsensures normal chlorophyll biosynthesis in Hexaploid wheat”的研究论文。该研究通过对突变体ygl2进行分析，发现黄绿色叶色由TaCHLI-7A基因缺失联合TaCHLI-7B基因截短突变控制，TaCHLI-7A和TaCHLI-7B间互补遗传效应可使叶色表现正常，为六倍体小麦进化过程中同源基因的功能研究提供了理论依据。

1. ygl2突变体表型特征

在S3025×S4185的F6群体中筛选出ygl2突变体，在田间条件下，ygl2三叶期叶片表现为黄绿色。S3025和S4185在整个生育期叶片的SPAD值较稳定，而ygl2叶片的SPAD值表现为越冬末期逐渐升高至正常水平，返青后叶片失绿，SPAD值降低至S4185和S3025的一半，灌浆期随着ygl2叶色恢复SPAD值升高，随后又缓慢下降。对比叶片叶绿素a和叶绿素b含量发现，S3025和S4185三叶期的叶绿素a和叶绿素b含量约为ygl2的2倍。透射电镜观察显示，S3025和S4185的叶绿体结构良好，有紧密堆叠的基粒片层，而ygl2的叶绿体发育异常，类囊体膜数量变少且无片层结构（图1）。

图1 ygl2突变体表型特征

2. ygl2基因图位克隆

1代叶色表现均正常，表明ygl2的黄绿叶色由隐性基因控制。利用YSI F2群体叶色差异表型混池，共鉴定出2113个多态性SNP，其中1945个SNP位于7B染色体，较集中在600-660 Mb区间内，因此推测ygl2基因位于7B染色体长臂。利用YSI F2群体的100株叶色表现为黄绿色的单株，将ygl2定位在标记M-18和M-23间，遗传区间为2.5 cM，物理区间为11.5 Mb。进一步利用YSI群体149个重组单株，将ygl2精细定位在标记M-164和AX–111526601间，遗传区间缩小至0.161 cM，物理区间缩小至784.2 kb。该区间包含10个高置信度基因，其中TaCHLI-7B编码镁螯合酶I亚基，推测可能为候选基因（图2）。

图2 ygl2基因图位克隆

扩增S3025和ygl2的TaCHLI-7B基因，基因长度为4945 bp，包含3个外显子和2个内含子。S3025的TaCHLI-7B基因序列与中国春完全一致，ygl2的TaCHLI-7B在第一个内含子的剪接位点发生G119T突变。S4185的TaCHLI-7B基因长度仅3919 bp，缺失了长度为1068 bp的5'UTR，且存在37个序列变异，其中A679C突变导致氨基酸改变，G119T突变可能影响转录本剪接。RACE分析表明，ygl2的TaCHLI-7B有两种转录本亚型，均编码49个氨基酸，缺少叶绿体信号肽和三个保守结构域（图3）。

图3 TaCHLI同源基因结构分析

3. TaCHLI-7A基因缺失联合TaCHLI-7B截短变异导致了ygl2表型

扩增S3025、S4185和ygl2的TaCHLI-7A和TaCHLI-7D基因，发现TaCHLI-7D基因长度为3420 bp且保守，而TaCHLI-7A基因仅能在S3025中扩增，S4185和ygl2中可能存在该基因的基因组片段缺失。共线性分析结果显示，除科农9204外，所有已公布的小麦参考基因组序列中均存在TaCHLI-7A基因组序列。

在小麦微核心种质中未发现TaCHLI-7A基因缺失，在144个现代品种中发现4个品种存在TaCHLI-7A基因缺失。筛选YSA F2群体，发现只有同时存在TaCHLI-7A基因缺失和截断的TaCHLI-7B基因的单株叶色表现出黄绿色表型，该基因型的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量低于其他基因型的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量（图4）。

2:3群体表型特征

4. TaCHLI-7B基因使ygl2叶色恢复

将完整TaCHLI-7B编码区及其调控元件的基因组片段转化ygl2，在T0代获得4株表现为正常叶色的转基因植株。在T2代，阳性植株叶色表型正常，阴性植株仍表现为ygl2表型。阳性转基因植株的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、镁螯合酶和ATP酶活性与S3025和S4185基本一致，证实TaCHLI-7B是叶色持绿所必需的。qRT-PCR结果显示，4个转基因植株中TaCHLI-7B的表达水平分别是S4185/S3025的2.77、2.42、4.76和4.68倍，ygl2中TaCHLI-7B的表达量极低（图5）。

图5 转基因植株的表型

5. 截短的TaCHLI-7B蛋白无法转运至叶绿体

将GFP融合到TaCHLI同源基因蛋白和Tachli-7B蛋白的C端，转化拟南芥原生质体。共聚焦显微镜观察到TaCHLI-7A-GFP、TaCHLI-7B-GFP和TaCHLI-7D-GFP荧光信号均可在叶绿体中检测到，而Tachli-7B-GFP的荧光信号在细胞质中检测到，表明截短的Tachli-7B蛋白无法转运至叶绿体（图6）。

图6 CHLI蛋白的亚细胞定位

总结

本研究克隆了导致小麦叶色表现黄绿色的ygl2基因，发现TaCHLI-7A基因缺失和TaCHLI-7B基因截短变异同时存在会导致小麦叶色呈黄绿色，TaCHLI-7A和TaCHLI-7B间互补遗传效应可使叶色表现正常。本研究有助于深入理解多倍体植物基因进化，为小麦遗传改良提供理论基础，对培育具有更好光合效率的小麦品种具有重要意义。

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