摘要：目前基于人脑组织的体外模型面临着几个挑战，包括二维或三维神经干细胞培养中的细胞异质性有限，组织切片培养存活时间短。Anna Pagliaro等人建立了一个培养条件，通过保持组织完整性直接从人类胎儿脑组织中获得类器官培养物，可以长期扩增并显示细胞异质性和复杂组织

目前基于人脑组织的体外模型面临着几个挑战，包括二维或三维神经干细胞培养中的细胞异质性有限，组织切片培养存活时间短。Anna Pagliaro等人建立了一个培养条件，通过保持组织完整性直接从人类胎儿脑组织中获得类器官培养物，可以长期扩增并显示细胞异质性和复杂组织。本方案描述了建立人类胎儿脑类器官（FeBO）的详细过程及它们的传代和表征；以及应用于FeBO的基因组工程方法，以产生突变的FeBO系，作为脑癌模型。最后说明了健康和突变FeBO的应用。

文章介绍

题目：Generation of human fetal brain organoids and their CRISPR engineering for brain tumor modeling

杂志：Nature Protocols

影响因子：13.1

发表日期：2025年2月

#1

研究背景

Background

人类大脑在其结构和发育过程中表现出独特的特征。人们已经开发了各种不同的体外培养系统研究脑在健康和疾病中的特征。早期的研究产生了基于组织材料的更简单的培养策略，包括贴壁神经干细胞培养物或球体，以及短期组织切片培养物。使用不同的原始细胞，建立培养条件以促进人类多能干细胞（PSC）以2D或3D构型神经分化。PSC源性脑类器官领域无疑提供了产生高度复杂和创新的体外模拟发育中的人脑的机会，并在模型改进以及阐明发育，疾病和进化机制方面取得了持续进展。

尽管如此，还是可以发现一些与PSC特性相关的困难，例如PSC系之间在分化能力等方面的差异、PSC培养过程中（外）遗传畸变的存在或获得，以及需要外源模式化分子来指导特征的获得。此外，每个PSC源性脑类器官的终极分化和有限的进一步扩展会阻碍它们在下游二次应用中的可扩展性，这与建立肿瘤模型特别相关。

#2

研究思路

Methods

①生成FeBO并进行传代和表征

②进行FeBO的基因工程以建立脑肿瘤模型

③FeBO的应用

实验设计

图1 实验方案示意图。工作流程包括用于产生、培养和表征FeBO的深入程序（程序1），进行FeBO的基因工程以建立自下而上的肿瘤模型（程序2）和可能的下游应用（程序3）。

本方案描述了如何建立、CRISPR基因编辑和使用来自健康人类胎儿脑组织的FeBO。在程序1中，首先描述如何将组织处理成组织碎片，然后描述了如何培养这些片段以衍生出类器官。进一步描述了如何识别起始组织块的区域身份，描述了如何在培养物中长期扩增（传代）FeBO，还讨论了如何通过改变培养条件使FeBO进一步成熟。在程序2中，描述了如何在FeBO中进行基因工程以研究脑癌突变和建立自下而上的脑肿瘤模型，包括转染方法和MT FeBO系的建立。在程序3中，描述了健康和MT FeBO的可能应用，首先描述如何进行化合物筛选，如使用健康FeBO研究脑扩张的各个方面，而MT FeBO可用于突变依赖性药物敏感性分析，还描述了如何在MT和健康FeBO之间建立共培养物。

Box1和Box2分别描述了如何进行FeBO的免疫荧光染色以及如何对基因组工程化的FeBO进行基因分型。

#3

预期结果

Results

本研究已经从GW10-17的组织中产生FeBO，并且可以从每个供体的单个组织碎片中获得多个不同的类器官系。FeBO培养物的建立应需要约20-30天。在建立阶段期间向外生长的FeBO可以作为单个结构或融合结构存在，同时逐渐获得可以分成较小块的明确边界，以产生具有明确边界的直径~2-3 mm的单个类器官（图2a）；当在明视野显微镜下观察时，成功的FeBO培养物应该呈现为具有明确的半透明边界的球形结构，具有更致密和更暗的核心，并且可以呈现表面折叠，推测与干细胞扩增有关（图2b）。在培养期间，定义了一组qPCR标记物，其可基于所选基因的表达快速用于广泛区分背侧前脑或腹侧前脑；免疫荧光进一步确认组织，大多数组织碎片是端脑起源的（FOXG1+），与供体组织该区域的丰度很好地吻合（图2c）。取决于区域来源，背侧前脑FeBO呈递PAX6+干细胞，而腹侧前脑FeBO富集DLX2+、NKX2-1+细胞（图2c）。本研究已从10个不同的供体中产生了FeBO，并使用前脑材料在各个组织碎片中的成功率通常>90%（图2d）。通过免疫荧光和使用多个供体中不同FeBO的全转录组学表征，在不同扩增FeBO系和供体中观察到相似的细胞组成。

图2 组织处理和FeBO培养物的建立。

FeBO定期分裂类器官，准备好分裂的FeBO的最佳尺寸在~2-3 mm直径的范围内（图3a）。当FeBO通过免疫荧光染色表征时，增殖的神经干细胞/祖细胞（SOX2+，Ki67+），包括外部放射状胶质细胞（HOPX+）通常在FeBO的外部形成厚层，而更分化的神经元细胞（TUJ1+）朝向FeBO的中心产生（图3b-f）。在长培养时间之后，FeBO生长通常减慢，因此需要较慢的传代速率，这可能是由于随时间推移略微趋于成熟，如分化标志物（DCX）（图3c-d）。可以培养FeBO最多约一年，但通常用2-4个月龄的培养物进行实验。当通过将环境从扩增切换到成熟培养基来启动进一步成熟时，FeBO降低祖细胞和增殖标志物的表达，同时增加神经元和星形胶质细胞标志物的表达（图3g-h）。

图3 FeBO系的培养、传代和表征。

本研们设计了稀疏靶向驻留在FeBO边界的神经祖细胞的条件，通过比色皿电穿孔用DNA转染小FeBO片段（图4a）。24小时后，FeBO内的这些稀疏转染的表达Cas9的细胞可以通过由所需的单向导RNA（sgRNA）-Cas9构建体共表达的瞬时荧光蛋白可视化（图4b）。通过同时整合转座荧光蛋白，这允许实时监测电穿孔的（可能是MT）细胞动力学及其过度生长野生型（WT）细胞群的能力（图4c-d）。经过重复的FeBO传代（约2-4个月），有效的MT细胞群继续富集，最终导致FeBO完全由MT细胞组成（图4d）。这取决于引入的特定突变（组合）的生长抑制作用。另外，由于MT细胞的完全富集需要时间并且需要重复分裂含有MT细胞的FeBO，因此在电穿孔后早期阶段的传代过程中，可能产生不含MT细胞或具有很少MT细胞的片段，其可以被丢弃（图4d）。

图4 用于脑肿瘤建模的FeBO的基因工程。

FeBO方案可用于各种发育研究和研究疾病，特别是癌症。在这方面，从单个初始片段扩增FeBO的可能性促进了FeBO的下游应用（图5a-c）。

图5 FeBO可能的下游应用。

#4

应用与展望

Application and Prospect

FeBO方案可用于各种发育研究和研究疾病，特别是癌症。FeBO特别适合于揭示人脑扩张的潜在机制，这一机制由大量存在的外部放射状胶质细胞和神经干细胞多样性表示；它们也可以作为一个培养系统来研究原始建立的区域相似的属性；组织样ECM小生态将FeBO定位为在人脑扩增和细胞分化的背景下研究ECM生物学的有价值的模型。FeBO的基因工程建立了一个强大的平台，在体外模拟脑肿瘤的发生。

本研究通过引入TP53、PTEN和NF1基因的三重敲除组合来模拟胶质母细胞瘤，展示了这种方法的多功能性。这种MT FeBO系代表了用于下游应用的可扩展和可再现的系统。其中包括药物筛选试验，以揭示突变依赖性敏感性。此外，WT（健康）和MT FeBO之间共培养物的产生建立了研究侵袭能力和细胞行为的平台。在这种情况下，WT FeBO也可以代表在其他环境中作为宿主组织的有吸引力的模型，例如用于源自原发性脑肿瘤的类器官。从不同区域和不同发育窗口（胎龄）建立FeBO将能够研究大脑扩展的各个方面，天然指定的区域身份和细胞可塑性。除了构成一个强大的癌症平台外，还可以预见FeBO可能对研究神经系统的其他（传染性）疾病和评估治疗递送系统有价值。可以从与大脑发育相关的先天性疾病影响的组织中建立FeBO，以研究相关的生物学。

与其他方法的比较

1、与其他人脑模型系统的比较

FeBO的特征在多个方面都不同。FeBO直接来源于具有定义的组织身份的天然指定的脑区域。FeBO培养使组织保持在扩张状态，其不会自发地遵循发育轨迹，但当转换到成熟培养基时可以诱导进一步成熟。该特征允许从可以在培养中扩增的单个组织片段快速可扩展地生成区域FeBO系，这促进了下游稳健性，并提供了研究神经干细胞异质性和脑扩增方面的有价值的模型。与组织培养系统相比，胎脑组织培养物以2D贴壁培养物以及神经球的形式衍生。人脑切片培养的短期存活（约10-20天），持续的细胞死亡和无法进一步扩增组织限制了它们的使用和可重复性，因此需要大量的组织。而FeBO代表了一种组织来源的培养系统，其保留了细胞异质性，呈现出复杂的组织结构，并且可以从少量的起始组织材料长期扩增成类器官系。总之，FeBO构成了一个简单，快速扩展和可操作的培养系统，以探究发育中的人脑的各个方面。

2、与其他人脑肿瘤模型系统的比较

从WT细胞开始工程化以模拟肿瘤的类器官的模型仍然很少。使用CRISPR/转座酶构建体的核转染在神经诱导阶段对PSC源性脑类器官进行遗传工程改造，从而研究几种脑癌突变组合的致瘤能力。然而，所得到的工程化脑肿瘤类器官的体外扩增能力尚未得到证实。这意味着每个类器官都是一个独特的实验，可用于单一的下游应用。因此，此类模型很难针对更高通量的应用（例如药物筛查）进行修改。在PSC状态下引入脑癌突变，随后将这些克隆系分化成脑类器官，减轻了上述限制中的一些，但不可避免地引入了此类基因在PSC水平和分化轨迹上的影响的混杂因素，并且与体内人脑肿瘤的起源细胞不匹配。FeBO中的脑肿瘤建模与上述许多限制无关，并为更高通量的下游分析提供了机会。基因工程方法允许在具有细胞异质性的WT组织样环境中实时跟踪癌症突变的影响。随后获得具有可以长期扩展的限定的初始基因型的MT FeBO系的能力赋予下游应用的再现性。

3、局限性

生成FeBO的能力取决于对人类胎儿组织的可及性，由于伦理和法律的限制，这在一些国家可能受到限制。然而，FeBO可以从少量的人类胎儿脑组织产生不同的FeBO系，并且这些FeBO系可以在培养物中快速扩增。还需要进一步研究来评估FeBO是否可以来自除前脑（皮质和腹侧前脑）外的其他区域，如中脑或后脑。也许可以通过评估不同的培养基，并建立可信度高的组织身份鉴定方法来实现这一目标。虽然可以自信地回溯分配组织区域身份，但是分配相关亚区域仍然是困难的。虽然不同皮质来源的FeBO系的大量转录组与不同的皮质区域身份相关，但这是基于回顾性分析，因此只能假设起源于这些亚区域。在这方面，获取完整的人类胎儿脑组织可以允许显微解剖更精确的区域，其可以随后培养为FeBO。

本研究开发了FeBO的成熟培养基以促进FeBO的进一步成熟，其中神经元和星形胶质细胞的丰度大幅快速增加，但是否可以捕获精确的发育轨迹需要进一步研究。该成熟培养基还可以进一步改进并针对不同区域的FeBO进行定制，以捕获区域特定的成熟特征。FeBO不保留内皮细胞和免疫细胞，其在发育和致癌过程中均起作用，进一步的研究应该解决与内皮细胞和免疫细胞共培养FeBO的可能性。在长培养期之后，FeBO以较慢的速率扩增，因此建议在可能的情况下使用培养时间短的FeBO。

FeBO的基因工程策略可用于评估脑癌突变的效力。这也使得能够建立限定突变组合的长期可扩展MT FeBO系。然而，后者本质上取决于在健康FeBO中富集的突变的效力。因此，这种方法对于研究脑癌突变潜力和生成强大的同基因脑肿瘤模型特别强大，而在其他情况下研究基因功能则不太通用。

实验程序

程序1：FeBO系的建立和维护

（一）胎儿脑组织处理：2-3 h

■ 注意：在收集和使用组织之前，应获得适当的监管和知情同意。

▲关键步骤：在开始人类胎儿脑组织处理之前，新制备洗涤缓冲液和扩增培养基。

（1）将获得的人类胎儿脑组织在无菌容器中的足够的DMEM或类似培养基中洗涤，并将其在冰袋上运输至生物安全I级的细胞培养实验室。

■ 注意：组织材料可在冰袋中保存24-48小时。

（2）将组织分到2-4个100 mm细胞培养板上。小心地将容器中的内容物倒入细胞培养板中。

（3）吸取DMEM或类似培养基，并加入大量（约5-10 mL）冷清洗缓冲液清洗组织。在取出并添加新的清洗缓冲液时，小心使用P1000移液器，不要抽吸或破坏组织。重复此洗涤步骤2-3次。

（4）在具有外部光源的体视显微镜下，使用显微解剖剪和镊子识别并去除明显的坏死组织块或区域。应使用带钝头的P1000移液器抽吸血管和毛细血管，以及碎片和小组织块（直径

（5）根据大小（最佳的碎片直径通常约为0.5-2.5 cm），将每个单独的组织碎片转移到含有适当体积清洗缓冲液（6孔板约5 mL，12孔板约2.5 mL）的6孔或12孔板的孔中。单个片段应置于单个孔中。使用镊子或带有钝头的P1000移液管小心移动碎片。在此过程中避免损伤组织。

（6）使用显微解剖剪将每个碎片切割成直径约1-2 mm的等份。使用细尖镊子和显微解剖剪，有助于在切割组织时将组织固定到位。

▲关键步骤：避免大面积切碎组织。经处理的碎片的最佳尺寸在直径1至2 mm之间。加工碎片的起始尺寸可影响FeBO形成效率。

（7）对于步骤6中处理的每个组织碎片，收集一个或多个直径约0.5 mm的切片用于RNA分离。分离RNA并生成cDNA，以进行qPCR分析，从而使用表1中列出的一组标记物分配区域同一性。该表提供了与标准SYBR绿色qPCR方案兼容的引物。

▲关键步骤：识别大脑区域身份对于后续应用/分析非常重要。组织特征的确定最初使用一组qPCR引物进行（仅需要1-2天），随后可以使用全转录组分析和使用生物信息学工具（如VoxHunt）进一步验证。

（8）（可选）对于步骤6中处理的每个组织碎片，收集约1 mm的组织片进行固定和进一步免疫荧光分析，与Box1中FeBOs的描述相似。

（二）FeBO系的建立和维护：2-3周

（9）在培养前将扩增培养基在37℃下预热。

（10）将处理程序（步骤6）中获得的组织块用带有钝头的P1000移液器转移到12孔板中，每个孔含有1.5 mL扩增培养基。在每个孔中，接种约5-10片，全部来自相同的初始片段。来自相同原始组织碎片的每个组织块被认为是相同FeBO系的一部分。

▲关键步骤：重要的是，要从步骤6的每个组织碎片建立单独的FeBO系，这样才能在步骤7-8的分析中将脑区特征追溯到每个FeBO系。

（11）将含有处理过的碎片的平板移至含有定轨振荡器的培养箱中。在定轨振荡器上在37 ℃和5% CO2下在恒定旋转（60 rpm）下进行培养。FeBO的初始形成预计在约5-7天内。

▲关键步骤：FeBO应在接种后5-7天内形成明确的边界。在此阶段，不同部件的融合是频繁的。如果形成的FeBO显示出不确定的边界和过度的组织脱落，则形成的类器官被认为是次优的或失败的，并且应该使用具有钝切尖端的P1000移液器将其吸出培养液。

（12）一旦形成的FeBO达到直径约2-3 mm的尺寸，或者如果单个碎片大量融合（约10-15天后），则是分裂它们的最佳时刻。使用带有钝头的P1000移液器将其移至含有预热清洗缓冲液的新12孔板中。

（13）通过使用显微解剖剪刀将形成的FeBO切成2-4个更小的碎片来将它们分开。切割的FeBO片的直径理想地应为约0.5-1.5 mm。使用细尖镊子和显微解剖剪有助于在切割时将FeBO保持在适当位置。在初始培养建立期间，当需要分离大的融合片段时，建议将其分成较大的碎片（直径约2 mm）。

▲关键步骤：不要将组织撕开。明确的切口可使FeBO在分裂后得到最佳的重组。切割大小相近、形状规则的碎片，避免产生过小的组织碎片。

（14）清洗一次切片，以去除切割过程中可能产生的死细胞和碎片。为此，将培养板倾斜45°，使碎片下沉到孔的一侧，使用玻璃巴斯德移液管或P1000移液管小心吸出大部分洗涤缓冲液，同时避免接触或吸出FeBO碎片。加入1 mL 37℃预热的洗涤缓冲液。

（15）使用具有钝切尖端的P1000移液管将少量洗涤缓冲液中的分裂的FeBO片段移动到12孔板的新孔中，最佳密度为每孔1-3个FeBO碎片。

（16）添加扩增培养基，确保完全覆盖分裂的FeBO片段。通常12孔板1孔的最佳扩展培养基量为2 mL。将平板放回培养箱中的定轨振荡器中。FeBO应在2-4天内形成清晰的边缘。在扩增期间，FeBO可以通过各种方法表征，包括免疫荧光、转录组学分析等。FeBO在建立和/分裂后重新形成后，可在任何所需时间点进行表征（与步骤7-8和Box1中针对组织所述类似）。

▲关键步骤：在培养约2-3周后，应从原始组织的单个初始片段成功建立多个可行且最佳的FeBO。这被定义为FeBO系。预计约90%的原始组织块应能够产生FeBO系（这已从前脑组织中广泛确定）。这种培养方法对其他脑区的适应可能需要进一步测试，应检查FeBO成功建立的相关百分比。

（17）每3-4天更新一次扩展培养基。在培养的前1-3个月期间，可能需要更频繁地更新培养基（即每2天更新一次，较年轻的FeBO培养物的生长速率通常更快。更新培养基时，将培养板倾斜45°，使FeBO沉降在孔底部，使用玻璃巴斯德移液管或P1000移液管小心抽吸，同时避免意外抽吸FeBO。在12孔板的每孔中保留约0.5 mL现有扩增培养基。加入1 mL 37℃下预热的新鲜扩增培养基。

（18）一旦从初始组织碎片建立FeBO，当FeBO直径达到约2-3 mm时，每2周定期分离FeBO，如步骤13-16所述。

▲关键步骤：培养6个月后，FeBO的生长速度通常会降低，FeBO应以更长的时间间隔（每3-4周）进行分裂。

（19）只要FeBO仍在扩增，就可以传代。FeBO系可以传代长达1年。可以在任何给定时刻收集FeBO用于表征（与步骤7-8和Box1中针对组织所述类似）。或者：①进行步骤20以诱导进一步成熟；②进行步骤24以冷冻保存FeBO；③进行程序3以用于下游应用。

（三）FeBO的进一步成熟：3-10天

▲关键步骤：FeBO一旦在分裂后（分裂后~3天）重新形成，就可以通过转换到成熟培养基来诱导其进一步成熟。当类器官呈现明确的边界并且直径大小为约1.5-2 mm时，开始FeBO的成熟。避免在FeBO尺寸直径>2 mm时开始熟化，因为这可能导致次优熟化。

（20）通过使用玻璃巴斯德移液管或P1000移液管并通过以45°倾斜培养板以使FeBO下沉到孔底部以防止意外吸入FeBO，小心地抽吸扩增培养基。吸出所有扩增培养基，加入1 mL洗涤缓冲液。

（21）小心地完全吸出洗涤缓冲液，并添加成熟培养基以完全覆盖FeBO（12孔板约2 mL）。

▲关键步骤：由于成熟培养基中含有BME，因此在将成熟培养基添加到FeBO中之前，将培养基保持在冰上非常重要。

（22）将平板放回培养箱中的定轨振荡器中，每隔一天更换一次成熟培养基。FeBO可以在成熟培养基中维持至少3-10天，这取决于下游分析。

（23）收集FeBO用于表征。在成熟培养基中培养的FeBO可以通过几种方法表征，包括免疫荧光、转录组学分析等。

（四）FeBO的冻存：1天

■ 注意：确保许可证明涵盖胎儿组织和衍生类器官的储存。

（24）如步骤13-14所述，将每个FeBO分成2-3片。切片直径应为~0.5-1 mm。

（25）使用带有钝头的P1000移液管将来自同一FeBO系的至少两个类器官的切片转移到一个无菌低温储存小瓶中，小心不要损坏FeBO切片。

（26）使用P1000或P200移液器从试管中吸出培养基，同时小心不要损坏收集的FeBO碎片。

（27）加入500 µL回收细胞培养冷冻培养基，轻轻敲击试管底部，确保FeBO片完全浸没。

（28）通过将冷冻管置于冷冻容器中冷冻FeBO，并将容器转移至-70℃至-80℃的冷冻机中过夜储存。

▲关键步骤：一旦FeBO碎片浸入回收细胞培养冷冻培养基中，应将样品迅速转移到-70℃至-80℃的冰箱中。

（29）24 h后，将干冰上的冷冻小瓶转移至液氮储存容器中进行长期储存。

■ 注意：低温保存的FeBO可在液氮中保存至少6个月。

（五）（可选）FeBO的解冻：3-5天

■ 注意：确保许可证明涵盖胎儿组织和衍生的类器官的储存。

（30）培养前将扩增培养基预热至37℃。

（31）在37℃水浴中快速解冻冷冻小瓶（步骤29），直至溶液解冻（约1-2分钟）。避免将小瓶完全浸没在水浴中，并避免关闭的瓶盖接触水。

（32）使用带钝头的P1000移液器将解冻的FeBO转移至预充有10 mL清洗缓冲液的15 mL锥形底试管中。

▲关键步骤：尽量减少与解冻的FeBO一起转移的冷冻溶液的量，并在转移FeBO时非常小心。

（33）轻轻倒置装有FeBO碎片的15 mL锥形底试管，以适当清洗解冻的FeBO。再重复此清洗步骤两次。使用5 mL清洗缓冲液进行最终清洗步骤。

（34）将含有FeBO碎片的试管内容物轻轻倒入6孔板的孔中。

（35）使用带钝头的P1000移液器，将解冻的FeBO转移至含有5 mL清洗缓冲液的6孔板的新孔中。

（36）以圆周运动轻轻移动平板，以进一步清洗解冻的FeBO。

（37）使用带有钝头的P1000移液器小心地将2-3个解冻的FeBO块转移至含有2 mL温热扩增培养基的12孔板的孔中。按照步骤11中所述培养解冻的FeBO。

（38）24小时后，必须从解冻的FeBO中除去细胞碎片。使用玻璃巴斯德移液器或P1000移液器小心吸取扩增培养基，并将培养板倾斜45°，使FeBO沉到孔底，以防止意外吸取FeBO。吸取所有扩增培养基，加入1 mL清洗缓冲液。

（39）小心吸取清洗缓冲液，加入新鲜的扩增培养基，以完全覆盖FeBO（12孔板约2 mL）。按照步骤16所述培养FeBO。

（40）仔细观察解冻的类器官的表型。在此阶段，FeBO碎片可能显示出较不清晰的边界和较多的细胞脱落。在5天内，FeBO将恢复并自组织成具有明确的半透明边界的3D结构。冷冻后未恢复的FeBO应丢弃。

（41）如步骤13-19所述，培养和传代解冻的FeBO系。

（42）在随后的传代过程中，继续仔细观察解冻的类器官的表型。表型（形态学、生长速度和组织表征）应与冷冻保存前相似。

程序2：FeBO的基因编辑

（一）DNA混合物的制备：30分钟

（1）通过合并以下质粒制备DNA质粒混合物：①pCAS9-mCherry-Frame；②pSPgRNA与克隆用于Cas9介导的基因敲除的所需sgRNA(s)或用于过表达的表达所需基因的PBCAG；③pCAG-PBase；④PBCAG-eGFP对于每次电穿孔，应使用最多100 µg总DNA，并应考虑不同质粒的摩尔比。

▲关键步骤：能够跟踪基因工程细胞的长期生长至关重要。使用基于piggyBac的系统来实现荧光标记物的稳定整合。关键是要包括一个对照电穿孔条件，其中仅引入荧光标记物，用于在不同条件下进行比较。

（2）向DNA混合物中加入Opti-MEM，使最终体积为100 µL。

（二）FeBO的电穿孔：2-3 h

（3）在37℃下预热扩增培养基和洗涤缓冲液。

（4）使用具有钝头的P1000移液管将待电穿孔的FeBO转移到含有预热的洗涤缓冲液的6孔板的一个孔中。分裂后完全重整的膨胀FeBO应用于电穿孔。使用显微解剖剪将FeBO切成直径约1 mm的碎片。使用细尖镊子和显微解剖剪刀，可以帮助在切割时将类器官固定在适当的位置。

（5）使用具有钝头的P1000移液管将洗涤缓冲液中的3-4个FeBO转移到具有圆底的2 mL无菌安全锁定管中。避免损坏FeBO碎片。

（6）使用P200移液器，从管中吸出洗涤缓冲液，同时小心不要接触和损坏FeBO碎片。

（7）通过向含有FeBO碎片的试管中加入1 mL Opti-MEM清洗类器官碎片，轻轻倒置试管并在室温下孵育5分钟。

（8）使用P1000移液器，小心地从试管中吸出Opti-MEM，同时注意不要接触FeBO碎片。

（9）将100 µl Opti-MEM添加到FeBO碎片中。

（10）将步骤1-2中制备的100 µL Opti-MEM/DNA混合物加入FeBO中，轻轻敲击试管混合（总体积为200 µL）。

（11）在室温下孵育10分钟。

（12）使用带有钝头的P1000移液器将Opti-MEM/DNA混合物中的FeBO碎片转移到电穿孔比色皿（4 mm间隙）中。轻轻缓慢移液。

（13）将电穿孔比色皿插入Nepagene电穿孔仪的比色皿保持器中。使用以下设置进行电穿孔：穿孔脉冲（电压175 V；脉冲长度7.5 ms；脉冲间隔50 ms；脉冲数2；衰减率10%；极性+）和转移脉冲（电压20 V；脉冲长度50 ms；脉冲间隔50 ms；脉冲数5；衰减率40%；极性±）。

▲关键步骤：比色皿中的液体表面出现气泡，表明电穿孔成功。

（14）电穿孔后立即向比色皿中轻轻加入1 mL预热的扩增培养基。避免将扩增培养基直接添加在FeBO碎片上，而是添加在比色皿的壁上，因为FeBO碎片在电穿孔后可能是易碎的。使类器官碎片在室温下在比色皿中恢复10分钟。

（15）向6孔板的一个孔中加入5 mL预热的洗涤缓冲液。

（16）缓慢地上下移取比色皿中的液体几次，直到FeBO碎片漂浮在液体中，然后将它们倒入6孔板的孔中的洗涤缓冲液中。避免吸取FeBO碎片。

（17）向12孔板的每个孔中加入2 mL预热的扩增培养基，并使用具有钝切尖端的P1000移液管在最少量的洗涤缓冲液中将两个电穿孔的FeBO碎片转移到12孔板的每个孔中。

（18）如程序1的步骤13-19中所述培养FeBO。有明确边界的电穿孔的FeBO的完全恢复和再形成应花费2-3天。

（19）通过在荧光显微镜下评估pCAS 9-mCherry-Frame质粒表达的瞬时mCherry荧光信号，监测24和48 h后电穿孔的成功。预期电穿孔的细胞是分散的。

▲关键步骤：根据经验，多质粒的电穿孔导致DNA混合物中所有质粒的共转染率>90%。因此，永久荧光标记的细胞（来源于转座荧光蛋白的稳定整合）也可能用Cas9和sgRNA质粒转染，因此可能已经在预期的基因座成功编辑。

（三）MT FeBO系的建立：时间可变

（20）每1-2周使用配备有荧光灯的光学显微镜并在37℃和5%CO2的环境控制下采集全FeBO图像，以随时间跟踪具有稳定整合的荧光蛋白的细胞的生长。

▲关键步骤：在低曝光设置下采集图像，因为重复成像可能会降低FeBO活性。

（21）如程序1中步骤13-19所述培养、维持和分裂电穿孔的FeBO。在引入赋予MT细胞生长优势的致瘤突变后，可能需要更频繁的分裂。

▲关键步骤：在分离FeBO之前，在荧光显微镜下观察荧光信号以定位荧光细胞至关重要。如果荧光细胞仅在FeBO的一部分空间上生长，则可以通过在荧光显微镜下分裂分离荧光细胞富集的FeBO区域来富集MT区域。

（22）（可选）在MT细胞过度生长期间，显微解剖FeBO的富集荧光阳性区域的小部分用于基因型分析（Box2），同时将大部分FeBO保持在培养物中以产生MT FeBO系。可以随时间重复该程序以评估所需突变的存在并评估MT细胞随时间的可能富集。

（23）如果突变或突变组合赋予生长优势，则基因组工程化细胞能够过度生长野生型细胞。经过反复传代，可以建立完全MT FeBO（当荧光完全超过FeBO时）。当FeBO呈现均匀荧光时，确认基因型（Box2）。

（24）一旦确认MT FeBO的基因型，则如程序1的步骤13-19中所述分裂并维持类器官。当引入致瘤突变时，可能需要更频繁的分裂。此后，来自每个所得通道的每个MT FeBO被认为是MT FeBO系的一部分。

（25）MT FeBO系可用于一系列下游分析。①按照程序3，步骤1-7进行化合物筛选。②遵循程序3，步骤8-9，用于WT FeBO与来自MT FeBO的解离细胞的共培养（步骤8选项A）或用于WT FeBO碎片与MT FeBO碎片的共培养（步骤8选项B）。

程序3：下游应用

（一）在FeBO中进行化合物筛选：时间可变

（1）如程序1的步骤13-14所述，将FeBO切成直径约0.75-1 mm的较小碎片。确保每种待测化合物都有足够的FeBO重复样品，并包括足够的对照FeBO。

▲关键步骤：为了确保复制品之间的一致性，最基本的是初始FeBO碎片具有相似的尺寸。

（2）使用带有钝头的P1000移液管将每个FeBO碎片转移到含有750 μL预热扩增培养基的24孔板的孔中。

（3）当单个FeBO重新形成具有明确边界的类器官时（通常在分裂后3天），将FeBO分配到实验组中。

▲关键步骤：为了确保重复和实验条件之间的一致性，重整的FeBO应该具有非常相似的尺寸。因此，获取FeBO的明场图像并使用图像分析工具（如ImageJ）以测量不同FeBO的面积。如果存在关于其大小或健康外观的离群值，则将其从进一步的实验使用中排除。

（4）使用P1000移液管从不同实验组的FeBO中吸出扩增培养基。

（5）加入补充有稀释至适当浓度的所需化合物/药物的扩增培养基。或在来自步骤3的FeBO碎片重新形成类器官后，可以将它们转移到成熟培养基中，并在成熟培养基中进行如步骤4-7中所述的化合物筛选。

（6）根据具体的实验问题，将FeBO急性暴露于特定化合物（几小时至几天），以脉冲追踪模式或长期暴露于特定化合物。在后一种情况下，应每2-3天更换一次适当的培养基。然后应按照程序1的步骤13-19所述培养和传代FeBO。

（7）收集处理的和对照的FeBO用于在适当表征所需的时间点进行分析。表2总结了可能的进一步表征和读数的示例，以评估不同化合物的影响。

（二）WT和MT FeBO共培养：时间可变

（8）在WT和MT FeBO之间建立共培养物。按照选项A生成WT FeBO与已在单细胞中预处理和解离的MT FeBO的共培养物，或按照选项B生成MT和WT FeBO片段之间的共培养物。

选项A：WT FeBO与来自MT FeBO的解离细胞的共培养

(i) 使用显微解剖剪刀将MT FeBO切成直径约0.5 mm的碎片，并使用具有钝切尖端的P1000移液管将碎片转移到2 mL Safe-Lock管中。

(ii) 使用P1000移液器，从试管中吸出剩余培养基，加入1 mL不含钙和镁的1×HBSS，以清洗FeBO碎片。

▲关键步骤：重要的是要清洗FeBO碎片，以去除可能抑制后续酶反应的钙和镁。

(iii) 使用P1000移液器，尽可能多地吸取1×HBSS。

(iv) 按照制造商的说明书使用神经解离试剂盒将MT FeBO碎片解离成单细胞。

▲关键步骤：在解离步骤中，始终使用带钝头吸头的P1000移液器轻轻混合并重悬样品。

(v) 在4 ℃下以100×g将单细胞悬浮液浸泡10分钟。离心后，试管底部应可见细胞沉淀。

(vi) 使用P1000移液器，尽可能多地吸取酶反应。抽吸后应仅保留细胞团块。

(vii) 向单细胞中加入1 mL含钙和镁的1×HBSS，用带钝头的P1000移液器轻轻移液，小心重悬细胞团。通过重复步骤8A（v-vii）再进行两次洗涤。

(viii) 最后一次洗涤后，向单细胞中加入500 μL扩增培养基，并通过用带有钝头的P1000移液管轻轻移液小心重悬。

(ix) 为了计数细胞量，将10 µL解离细胞悬液与10 µL台盼蓝在1.5 mL Safe-Lock管中混合。将10 µL混合物转移至计数室，并在明视野显微镜下计数活细胞。正确的程序应导致高细胞活力（>80%）。为了侵入单个WT FeBO，使用范围从400至100.000的MT FeBO细胞数量，但最佳数量可能取决于MT FeBO中存在的特定突变和特定应用。建议评估不同的细胞数量。

(x) 将来自步骤8A(ix)的所需数量的解离的MT FeBO细胞重悬于1 mL扩增培养基中。

(xi) 从含有培养的单个WT FeBO的12孔中吸出培养基。

(xii) 向该孔中加入含有步骤8A(x)中制备的解离MT FeBO细胞悬液的扩增培养基。

(xiii) 如程序1的步骤13-19中所述培养共培养的FeBO。预期单个MT细胞在2-4天内植入WT FeBO中。继续执行步骤9。

▲关键步骤：在4天前或直至单个MT细胞可见植入WT FeBO中，不得将扩增培养基更换为共培养的FeBO。如果植入时间长于预期时间，可额外添加1 mL扩增培养基。

▲关键步骤：为了避免在悬浮液中形成MT细胞簇，使用P1000移液管小心地上下移取扩增培养基2-3次，每天1-2次，直到所有MT细胞都移入WT FeBO中。期间避免损坏WT FeBO。

选项B：MT和WT FeBO碎片的共培养

(i) 使用显微解剖剪将MT FeBO切成约0.5 mm的碎片。

▲关键步骤：产生相似尺寸的FeBO碎片以具有可比的重复是必要的。

(ii) 尽可能多地去除培养基，并通过加入1 mL洗涤缓冲液洗涤片段一次。使用带有钝头的P1000移液器，将每一片放入12孔板的不同孔中，并用2 mL扩增培养基覆盖。

(iii) 使用WT FeBO重复步骤8B(i-ii)以生成类似尺寸的WT FeBO碎片。

(iv) 使用带有钝头的P1000移液器，将一个WT FeBO碎片转移至含有来自步骤8B(ii)的MT FeBO的每个孔中。

(v) 如程序1的步骤13-19所述培养共培养的FeBO。3-4天后，MT和WT FeBO预期融合并重新形成为单个MT-WT融合FeBO。继续执行步骤9。

选项A和B：跟踪MT细胞的侵袭和生长

（9）通过评估荧光MT细胞的扩增和位置，跟踪WT FeBO中不同MT FeBO细胞的生长和侵袭动力学。建议定期（每周1-2次）使用共聚焦显微镜获取图片。可以对共培养的类器官进行化合物筛选，如步骤4-7中所述。化合物暴露的开始和持续时间取决于实验问题，应由用户确定。

▲关键步骤：进行实时成像时，在开始前30分钟将环境控制设置为37℃和5%CO2。为了进一步降低成像过程中的细胞应力，请将激光功率设置为最小值，同时最大限度地提高图像采集速度。

故障排除

生物材料

试剂

设备

试剂配制

参考文献

Pagliaro A, Andreatta F, Finger R, Artegiani B, Hendriks D. Generation of human fetal brain organoids and their CRISPR engineering for brain tumor modeling. Nat Protoc. 2025 Feb 6. doi: 10.1038/s41596-024-01107-7. Epub ahead of print. PMID: 39915620.

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来源：培养盒守护者