NAPTUNE：无需扩增，45分钟单管超灵敏核酸检测

摘要：核酸和蛋白质生物标志物的早期可靠检测对于疾病控制、精确治疗和监测至关重要。金标准方法，如qRT-PCR通过检测核酸彻底改变了诊断，免疫学方法被广泛用于检测蛋白质标记物。然而，这些方法通常涉及操作复杂性、耗时（从4到6小时），以及需使用专用设备。CRISPR/C

核酸和蛋白质生物标志物的早期可靠检测对于疾病控制、精确治疗和监测至关重要。金标准方法，如qRT-PCR通过检测核酸彻底改变了诊断，免疫学方法被广泛用于检测蛋白质标记物。然而，这些方法通常涉及操作复杂性、耗时（从4到6小时），以及需使用专用设备。CRISPR/Cas系统因其在分子诊断中的潜力而引起了人们的关注。尽管前景看好，但对PAM基序的依赖，以及gRNA成本增加和不稳定性，可能会阻碍CRISPR/Cas系统在诊断中的广泛应用。

近日，杂志Nature communications上发表了一篇题为“NAPTUNE: nucleic acids and protein biomarkers testing via ultra-sensitive nucleases escalation”的文章。作者开发了NAPTUNE平台，无需放大步骤，利用APE1和PfAgo内切酶的协同酶活性，在45min内实现了单管反应对aM水平核酸的超灵敏检测。此外，使用NAPTUNE平台还可对低至1.25ng/ml的FEN1进行高灵敏度和选择性检测。

图片来源：Nature communications

主要内容

基于原位级联的NAPTUNE开发

作者设计了一个原位级联信号放大系统，利用串联APE1和PfAgo内切酶的协同作用，命名为NAPTUNE。首先，APE1本身具有高特异性和指数级信号放大能力，能够建立目标核酸检测的正反馈回路。同时，APE1触发的裂解产物可以作为gDNA的向导，在二级和三级探针上激活pfAgo介导的顺式裂解系统，从而将APE1的靶向能力转化为“APE1- argonaut”原位级联扩增荧光信号模式。简单来说，在整个级联反应中，作者引入了三个ssDNA探针，分别为P1、P2和P3。P1介导APE1对靶标RNA的识别和切割，并启动PfAgo对P2的切割；截断P2作为gDNA，与guide-free PfAgo结合，促进了P3的特异性后续切割（如下图）。这种模式消除了复杂放大步骤的需要，使检测过程更快，更具成本效益，适合POCT应用。

原位级联信号放大系统NAPTUNE平台原理简述

图片来源：Nature communications

NAPUNE平台概述及表征

作者尝试APE1和PfAgo级联反应的单管反应来简化程序。结果显示，设计一个常规0.2 mL的迷你管，将PfAgo反应系统放入其中，从而分离PfAgo和APE1反应系统，该设计明显优于PfAgo反应系统在管壁或管帽上的常规布置。经过对反应温度、缓冲液成分、酶和探针浓度的多次优化，NAPUNE平台的整体周转时间明显缩短到仅仅45分钟。

作者选择circRNA1141、HOTAIR和miR-21来证明NAPTUNE平台的可行性。结果显示，NAPTUNE平台对这三种ncRNA表现出良好的性能，灵敏度均低至1 aM（图c），与标准qRT-PCR检测相当（图d）；且具有高度特异性，交叉反应性小（图e）。作者进一步证明了NAPTUNE平台在单管中检测双重RNA靶标HOTAIR和miR-21时表现出高敏感和精确性（图h）。

NAPUNE平台的性能表征

图片来源：Nature communications

NAPTUNE在处理临床样品方面

显示出强大的活性

作者使用NAPTUNE测量了临床样本中miR-21的表达水平。NAPTUNE检测显示出与qRT-PCR方法显著的一致性，灵敏度为95.0%，特异性为100.0%，阴性准确性为97.5%（图e-g）。与qRT-PCR相比，NAPTUNE利用荧光读取器导致阴性阳性样本显示出了更明显的差异。阴性和阳性结果产生19倍的荧光差值变化，显著提高了区分阴性和阳性结果的便利性（图i）。

除此之外，NAPTUNE检测的核心酶APE1已被确定为许多癌症的蛋白质生物标志物，因此，作者还探索了NAPTUNE试验是否能有效识别患者血浆样本中这些酶的存在。结果显示，NAPTUNE用于检测FEN1（APE1的同源蛋白），LOD低至1.25 ng/ml，与ELISA性能相似。

总之，NAPTUNE提供了一种简单、可靠、快速（45分钟）且具有成本效益的ncRNA和蛋白质生物标志物检测方法，能够在相关癌症的早期阶段进行有效诊断。