Mol Cell | 孙锐/Robert Fisher揭示CDK9磷酸化SPT5控制RNAPII暂停释放和转录延伸新机制

摘要：蛋白质磷酸化和去磷酸化修饰是RNA聚合酶II（RNAPII）转录周期中的重要调控手段。其中，RNAPII及其辅助因子的可逆磷酸化对于基因表达的速度和质量控制尤为重要，其控制着正常细胞的生长发育过程，并且在癌细胞中经常处于被错调或篡改的状态。

蛋白质磷酸化和去磷酸化修饰是RNA聚合酶II（RNAPII）转录周期中的重要调控手段。其中，RNAPII及其辅助因子的可逆磷酸化对于基因表达的速度和质量控制尤为重要，其控制着正常细胞的生长发育过程，并且在癌细胞中经常处于被错调或篡改的状态。

RNAPII的转录过程除了在转录起始阶段受到转录因子的调节，在转录起始后，还受到各种转录延伸机制的调控。当RNAPII起始复合物逃离启动子区域不久，其起始因子将会被延伸因子所取代而形成处于转录暂停状态的RNAPII延伸复合物，这其中包括由SPT4和SPT5组成的DRB敏感性诱导因子（DSIF）以及多亚基负延伸因子（NELF）。

RNAPII转录复合物的启动子近端暂停（promoter proximal pausing；暂停事件）是高级真核生物控制基因表达的关键控制点（check point），其控制着细胞中各种组成性或诱导性基因的即时表达。RNAPII暂停事件的释放过程依赖于正转录延伸因子b（P-TEFb）复合物（CDK9是复合物的催化亚基）。在暂停释放过程中，P-TEFb磷酸化RNAPII、SPT5和NELF，从而触发NELF的释放并且将DSIF转化为正延伸因子，然而，目前并不清楚这一系列的磷酸化事件是如何协调控制RNAPII暂停释放和转录延伸的。

SPT5是DSIF蛋白复合物中的大亚基，它是除了RNA聚合酶以外在所有生命形式中都保守的转录复合物组分，其在原核生物和古细菌中亦具有直系同源物。在最早鉴定SPT5基因的研究中就已发现其羧基末端重复序列（CTR）可以被CDK9磷酸化，由此确立了其在转录中的功能。脊椎动物SPT5的CTR区域可以明确的划分为CTR1 和CTR2，目前所研究的磷酸化集中于CTR1区域，CTR2是否会被磷酸化，以及其磷酸化是否参与转录调节仍然未知。更近一步的后续研究，特别是对真核生物转录延伸复合物结构的解析，发现SPT5的KOWx-4和KOW5结构域之间的柔性连接区（KOWx-4/5 Linker；连接区）在RNAPII暂停事件中通过结合新生（nascent）RNA发挥着关键作用，并且这一区域在后生动物细胞中也可以被CDK9磷酸化，然而，在转录过程中SPT5的CTR1和连接区磷酸化具有不同的基因组分布特征，CDK9是如何控制SPT5不同区域磷酸化的仍然不清楚。更多背景详见Sun和Fisher关于SPT5磷酸化的综述【1】。

2025年4月17日，纽约西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）Robert Fisher课题组在Molecular Cell杂志发表了题为Tripartite phosphorylation of SPT5 by CDK9 times pause release and tunes elongation rate of RNA polymerase II的文章（孙锐博士为第一作者），他们从SPT5磷酸化的角度探究了RNAPII暂停释放和转录延伸的机制。通过分析不同SPT5磷酸化缺陷突变体对基因转录过程的影响，他们发现CDK9可以通过SPT5三个不同区域（CTR1，CTR2以及连接区）的磷酸化协调基因的转录过程，这其中包括控制RNAPII暂停释放的时机，调节RNAPII转录延伸的速度，影响pre-mRNA的剪切以及RNAPII的转录终止。文章提出SPT5可以通过CTR1和CTR2延迟连接区磷酸化来帮助控制暂停释放的时机，并分别作为延伸RNAPII的加速器和制动器，以调节RNA加工和转录终止，从而确保有效的转录。

SPT5是转录机制研究的热点蛋白，在过去的几年中已经至少有三篇Molecule Cell的文章采用靶向蛋白降解系统（PROTAC）研究了SPT5在转录中的功能【2-4】，其中两篇文章确定了SPT5连接区磷酸化可以控制RNAPII暂停释放，而CTR1磷酸化主要影响转录终止。不同于之前发表的研究，在Sun和Fisher这篇最新的文章中，他们聚焦于SPT5磷酸化，采用靶向蛋白降解系统将内源dTAG-SPT5替换成了一系列SPT5磷酸化缺陷突变体，这包括单独区域突变以及各种组合突变。通过各种基因组学方法（ChIP-seq, RNA-seq, TTchem-seq, CUT&RUN）及生化分析(染色质分离, 免疫沉淀，免疫杂交，体外蛋白磷酸化)，他们系统研究了SPT5磷酸化缺陷对RNAPII转录及细胞正常生理活动的影响。

通过使用之前建立的SPT5磷酸化特异抗体，他们首先确定了SPT5的CTR1区域和连接区磷酸化相对独立，但他们意外地发现CTR1突变可以增强CTR2的磷酸化，这个增强的信号可以被SPT5连接区磷酸化抗体（pSer666）意外识别。对CTR2区域进行突变后，他们再次意外的发现CTR2磷酸化是SPT5电泳迁移率改变的主要因素。野生型SPT5在电泳中一般会分离成两条带，CTR1或者连接区突变并不会显著改变带型，然而，CTR2突变在不改变CTR1及连接区磷酸化的情况下使得SPT5迁移只呈现出一条主要带型。去磷酸化酶处理进一步确定了SPT5的CTR2区域在正常条件下是可以被磷酸化修饰的，并且大量存在。由于CTR2氨基酸序列的特殊性，一般的蛋白质质谱无法鉴定到CTR2区段，因此CTR2区域的磷酸化一直没有得到关注。

早期对斑马鱼SPT5的研究发现【5】，CTR2区域对于SPT5并不是必须的，在功能上可能和CTR1存在冗余，然而，CDK9体外磷酸化CTR2的效率显著低于磷酸化CTR1。逻辑上，CTR2磷酸化似乎并不能取代CTR1的磷酸化。作者接着分析了不同SPT5突变体对细胞生理活性及产生mRNA的影响。CTR1单独突变减少了mRNA的产生，但并没有对细胞的生理活性造成重大影响；CTR2单独突变对细胞的生理活性和mRNA的产生都没有显著的影响；然而，CTR1和CTR2的组合突变增强了CTR1单独突变的效应，细胞的生理活性受到了严重的破坏，这些结果与之前提到的CTR1和CTR2冗余性似乎一致。

作者进一步通过RNAPII ChIP-seq分析了不同SPT5磷酸化缺陷对RNAPII转录行为的影响。结果显示：虽然任一单独CTR区域的突变增加了启动子近端RNAPII的占有率（occupancy），CTR1和CTR2的组合突变反而大幅度的减少了RNAPII占有率，而连接区的额外突变可以恢复启动子近端RNAPII的占有率。RNAPII在启动子近端的占有率反映了RNAPII转录行为的动态平衡（进入暂停状态的频率和暂停释放的频率），由于连接区磷酸化控制着RNAPII暂停释放，SPT5连接区的突变抵消了CTR1和CTR2组合突变的效果，这说明大幅度减少的启动子近端RNAPII是由于增强的暂停释放造成的。作者在文章中提出了一个延时器模型来解释这个结果，由于CDK9偏好CTR1磷酸化，CTR1和CTR2可以通过延迟连接区磷酸化来帮助控制暂停释放的时机，这一模型可以被CDK9体外磷酸化SPT5的动力学过程所支持（这一机制并不独特，在许多蛋白多磷酸化修饰的研究中已有报道）。NVP2（CDK9特异性的抑制剂）处理可以得到和额外突变连接区类似的结果，从另一方面支持CTR1和CTR2组合突变的效果是由于增强的RNAPII暂停释放造成的。作者使用删除CTR2区域的突变体也可以得到相同的结论，排除了大范围突变可能造成的意外结果。在突变了SPT5所有CDK9磷酸化位点后，细胞仍然可以对NVP2做出反应，这说明其他转录延伸因子（如NELF）在转录暂停事件中发挥着重要作用。

作者额外探究了SPT5磷酸化缺陷对NELF及RNAPII磷酸化的影响。通过染色质分离和ChIP-seq，作者发现SPT5磷酸化突变显著的影响了NELF在启动子近端的占有率，其中CTR1磷酸化起到了最关键的作用，延时器模型同样可以用来解释这一结果：由于CDK9无法磷酸化SPT5上的众多位点，使得其更容易磷酸化NELF，从而减少了NELF的占有率。相较之下，SPT5磷酸化缺陷似乎并没有较大的改变RNAPII的磷酸化，一些有趣的结果还需要进一步的研究。

为了解释CTR1和CTR2突变在RNA-seq和RNAPII ChIP-seq所造成影响的差异，作者通过TTchem-seq分析了不同SPT5磷酸化缺陷对新生RNA合成的影响。与普通RNA-seq检测mRNA水平不同，TTchem-seq检测的新生RNA水平更能直接反映转录的输出（RNA output）。同RNA-seq的结果一致，CTR1单独突变主要减少了RNA的合成，CTR2单独突变对RNA的合成没有显著的影响，然而，CTR1和CTR2的组合突变对RNA的合成产生了特别的效果：受到CTR1单独突变影响的基因，其RNA的合成在CTR1和CTR2的组合突变后和CTR1单独突变相比并没有较大的变化（有些基因部分恢复了新生RNA的合成）；而一些长期处于暂停状态的基因（highly paused gene），CTR1和CTR2的组合突变促进了他们的转录，从而产生了更多的新生RNA，这与ChIP-seq的结果是一致的，即CTR1和CTR2组合突变促进了RNAPII暂停释放（意外释放）。连接区额外的突变部分逆转了CTR1和CTR2组合突变的效果，进一步支持前面所提到的解释。然而，CTR1和CTR2组合突变促进合成的新生RNA并没有反映在RNA-seq的结果中，说明这些意外合成的RNA在细胞内并不稳定。作者还发现，CTR1和CTR2的组合突变导致了RNAPII在部分基因中的“穿读”（read-through），提示SPT5磷酸化在转录终止阶段的作用。

值得注意的是，在这项研究工作中，CTR1单独突变显著的影响了RNAPII转录延伸的各个过程，区别于之前的类似研究，但与早期研究中对SPT5的CTR1磷酸化理解是一致的。CTR1单独突变导致RNAPII在基因转录区大量积累，但减少了新生RNA的合成，提示其对转录延伸速度的影响。作者通过DRB（RNAPII暂停释放抑制剂）同步转录，然后使用RNAPII CUT&RUN实际测定了细胞内RNAPII在转录中的延伸速度，他们发现CTR1单独突变显著减慢了RNAPII的转录延伸，而CTR1和CTR2的组合突变部分恢复了RNAPII的转录延伸速度。机制上，之前关于SPT5的结构研究已表明CTR1区域对于RTF1的招募起到关键作用【6】，而RTF1直接影响RNAPII的转录延伸速度【7】，这篇文章报导的CTR1突变的表型实际上是和RTF1的研究结果是一致的，从另外一个层面上确认了RNAPII转录延伸的机制，不仅如此，作者通过RTF1 ChIP-seq提供了上述联系的直接证据，并且发现CTR2的磷酸化可能会抑制CTR1对RTF1的招募，因此CTR1和CTR2在机制上并不是冗余的。

总的来说，这篇文章提出SPT5可以通过CTR1和CTR2延迟连接区磷酸化来帮助控制暂停释放的时机，并分别作为延伸RNAPII的加速器和制动器，以调节RNA加工和转录终止，从而确保有效的转录。

制版人：十一

参考文献

1. Sun, R., and Fisher, R.P. (2025). The CDK9-SPT5 Axis in Control of Transcription Elongation by RNAPII.J Mol Biol437, 168746. 10.1016/j.jmb.2024.168746.

2. Aoi, Y., Takahashi, Y.H., Shah, A.P., Iwanaszko, M., Rendleman, E.J., Khan, N.H., Cho, B.K., Goo, Y.A., Ganesan, S., Kelleher, N.L., and Shilatifard, A. (2021). SPT5 stabilization of promoter-proximal RNA polymerase II.Molecular Cell81, 4413-+. 10.1016/j.molcel.2021.08.006.

3. Fong, N., Sheridan, R.M., Ramachandran, S., and Bentley, D.L. (2022). The pausing zone and control of RNA polymerase II elongation by Spt5: Implications for the pause-release model.Mol Cell82, 3632-3645 e3634. 10.1016/j.molcel.2022.09.001.

4. Hu, S., Peng, L., Xu, C., Wang, Z., Song, A., and Chen, F.X. (2021). SPT5 stabilizes RNA polymerase II, orchestrates transcription cycles, and maintains the enhancer landscape.Mol Cell81, 4425-4439 e4426. 10.1016/j.molcel.2021.08.029.

5.Chen, H., Contreras, X., Yamaguchi, Y., Handa, H., Peterlin, B.M., and Guo, S. (2009). Repression of RNA polymerase II elongation in vivo is critically dependent on the C-terminus of Spt5.PLoS One4, e6918. 10.1371/journal.pone.0006918.

6. Vos, S.M., Farnung, L., Linden, A., Urlaub, H., and Cramer, P. (2020). Structure of complete Pol II-DSIF-PAF-SPT6 transcription complex reveals RTF1 allosteric activation.Nat Struct Mol Biol27, 668-677. 10.1038/s41594-020-0437-1.

7. Zumer, K., Maier, K.C., Farnung, L., Jaeger, M.G., Rus, P., Winter, G., and Cramer, P. (2021). Two distinct mechanisms of RNA polymerase II elongation stimulation in vivo.Mol Cell81, 3096-3109 e3098. 10.1016/j.molcel.2021.05.028.

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