Antiviral Research丨广州医科大学李锋团队成功建立无病毒HBV cccDNA高通量药物筛选细胞系

摘要：A hepatitis B virus-free cccDNA-producing stable cell for antiviral screening” 的研究论文。研究构建了一种无需病毒感染即可持续产生 HBV cccDNA 的稳定细胞系，该模型中， H

2025年3月14日，广州医科大学附属市八医院李锋团队在Antiviral Research发表了题为“

A hepatitis B virus-free cccDNA-producing stable cell for antiviral screening” 的研究论文。研究构建了一种无需病毒感染即可持续产生 HBV cccDNA 的稳定细胞系，该模型中， HBV cccDNA 表达一种可分泌的荧光素酶（ Gaussia Luciferase ， GLuc ），可非常简便地用于 HBV cccDNA 形成、维持、活性调节等的机制研究与药物高通量筛选。

实现HBV功能性治愈是目前临床治疗的理想目标。尽管现有抗病毒药物可有效抑制HBV病毒复制，有些患者也可实现功能性治愈，但，现在治疗策略对HBV cccDNA（共价闭合环状DNA）无能为力，HBV cccDNA在体内不但持续存在，而且可以活跃转录产生pgRNA，生产子代病毒。开发直接靶向HBV cccDNA的新型抗病毒药物迫在眉睫，然而，可供研究HBV cccDNA的细胞模型较少。一方面，HBV cccDNA 特异性检测技术不足。HBV cccDNA在细胞内的水平低，且与其他HBV病毒复制中间产物序列高度相似，常规PCR检测方法难以区分，经典Southern Blot方法灵敏度不够。另一方面，缺少适用于直接靶向HBV cccDNA的高通量药物筛选模型。

为克服以上难题，李锋团队开发设计了一种能够自主产生HBV cccDNA的细胞系。该系统具有以下特点。1.胞内HBV cccDNA水平提高。1）为避免插入报告基因增加HBV基因组长度导致病毒包装效率降低，该体系中利用功能互补策略，将病毒蛋白的产生和HBV前基因组RNA（pgRNA）生成分为两个独立部分，HBV病毒蛋白Core、Pol和HBx位于辅助部分（Helper），pgRNA provider的长度得到有效缩短，不会受插入报告基因的影响。2）该体系不表达HBsAg病毒蛋白，所转录产生的pgRNA均导向细胞内HBV cccDNA内循环。2.荧光素酶报告基因可作为活跃转录HBV cccDNA的替代性标志物。1）Gaussia荧光素酶仅来源于所形成的HBV cccDNA reporter，通过Gaussia荧光素酶（Gluc）报告系统精确反映细胞内cccDNA水平。2）Gluc以分泌形式释放到细胞培养基中，可轻松实现对同一实验孔中HBV cccDNA的连续检测。3. 双荧光素酶系统。同时，稳定表达HBV cccDNA的细胞基因组中引入萤火虫荧光素酶报告系统，可用于评估药物毒性与细胞活性。