摘要：延世大学研究团队针对全球癌症相关死亡首要病因——肺癌，开展了新型免疫调节抗癌策略探索，通过合成含不同取代基的吲哚基磷脂酶D（PLD）抑制剂以提升抗癌效能，经构效关系筛选出关键化合物3r。体外实验显示，3r可显著抑制PLD活性、肺癌细胞生长活力及迁移能力，并诱导
延世大学研究团队针对全球癌症相关死亡首要病因——肺癌，开展了新型免疫调节抗癌策略探索，通过合成含不同取代基的吲哚基磷脂酶D（PLD）抑制剂以提升抗癌效能，经构效关系筛选出关键化合物3r。体外实验显示，3r可显著抑制PLD活性、肺癌细胞生长活力及迁移能力，并诱导细胞凋亡；计算机模拟对接证实其与PLD1活性位点特异性结合，特定氨基酸残基在抑制PLD1活性中起关键作用；机制研究表明其能调控致癌通路并逆转肿瘤免疫逃逸。小鼠模型体内实验显示，该抑制剂可有效抑制肿瘤生长并调节免疫微环境，与吉西他滨联用时对肺癌细胞凋亡诱导和增殖抑制具有协同增效作用。研究表明，所开发的吲哚基PLD抑制剂兼具直接抗肿瘤与免疫调节双重活性，其与化疗药物联用的协同效应为肺癌治疗提供了新候选策略，有望推动基于PLD靶点的癌症免疫治疗研究进展。
药渡CyberSAR系统提供了对PLD1抑制剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。
研究背景
磷脂酶D（PLD）作为调控细胞信号网络的核心酶，其结构保守性与功能多样性在生命活动中至关重要。人类PLD1与PLD2同工酶因亚细胞定位（如PLD1定位于胞质/高尔基体，PLD2分布于质膜/内体）及信号调控差异，在肿瘤进程中呈现不同角色：PLD1通过PI3K/Akt、ERK通路驱动癌细胞增殖侵袭，其高表达与肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的不良预后密切相关。
在肿瘤免疫微环境中，PLD1通过双重机制影响抗肿瘤免疫：一方面抑制细胞毒性T细胞活化并增强Treg免疫抑制功能，另一方面通过上调“别吃我”信号（CD24/CD47/PD-L1）阻断巨噬细胞吞噬清除。研究发现，抑制PLD1可恢复钙网蛋白（CRT）等“吃我”信号及免疫原性细胞死亡（ICD）通路，同时重塑巨噬细胞与中性粒细胞功能，显著降低动物模型中的肿瘤负荷与转移。
针对PLD1开发的吲哚基抑制剂通过结构优化，在体外实验中展现出强效酶抑制活性及细胞杀伤能力，与吉西他滨联用可协同增强凋亡诱导与增殖抑制效应；体内研究证实其通过调节免疫细胞浸润发挥抗肿瘤作用。该类化合物兼具直接杀伤肿瘤与重塑免疫微环境的双重功能，为肺癌等难治性肿瘤的免疫联合治疗提供了创新靶点与候选策略，具有重要的临床转化价值。
结果与讨论
PLD抑制剂的理性设计
研究基于前期发现的强效PLD1抑制剂VU0155069，通过药效团分析明确其关键结构特征：分子由含芳香环与氢键供体的左右末端片段、及含可电离正电荷的中心片段组成，其中末端片段为核心药效团，而中心基团可能影响药物代谢动力学性质（ADME）。据此设计策略聚焦于去除中心可电离基团、减少连接链可旋转键以优化ADME特性，同时通过调整芳香环间连接链长度并保留羰基结构，系统开展构效关系（SAR）研究，为开发兼具高活性与成药潜力的新型PLD抑制剂提供了理论依据与设计范式。
构效关系研究
研究以VU0155069为对照，合成32种化合物并在10 μM浓度下评估对HCT116结直肠癌细胞中PLD的抑制活性，通过检测PLD介导转磷脂酰化反应生成的[H3]磷脂酰丁醇（PtdBut）定量分析酶活性。结果显示，化合物3r、3ac和4c在该浓度下可使PLD活性降低超50%，为后续构效关系优化提供了关键活性化合物基础。
构效关系（SAR）分析显示，吲哚环取代基的电负性是影响PLD抑制活性的关键因素，其中-F、-CF3和-Cl取代基表现出显著优势。含苯基的化合物较苄基衍生物活性更优（如3b vs 3h），吲哚与酰胺基团间碳链长度为2时活性最佳（如3p、3r），而酰胺基团替换为酯基会导致活性下降（如3ac）。苯基多样化修饰进一步发现3f和4b具有优异抑制效果。在32种合成化合物中，3r、3ac和4c凭借特定结构修饰成为强效PLD抑制剂，为基于结构的药物优化提供了明确方向。
计算机模拟研究
研究基于PLD1晶体结构（PDB：6OHR）构建抑制剂相互作用模型，通过药效团分析定义疏水作用、芳香环、氢键供体等关键特征，从300种衍生物中筛选出拟合值（FitValues）前32的化合物进行合成，其中多数化合物拟合值＞2.5，3r表现尤为突出。对接模型验证显示，3r、3ac和4c均能正确结合于PLD1活性位点，但体外活性最高的4c结合能（-135.35 kcal/mol）低于3r（-152.72 kcal/mol）和3ac（-170.70 kcal/mol），提示结合能与酶抑制活性可能受多重因素共同调控。该计算机模拟与实验结合的策略为PLD抑制剂的高效筛选提供了可靠方法。
分子动力学（MD）模拟显示，化合物3ac具有最高结合能，其对接模式与3r、4c相反。3r与PLD1形成的复合物均方根偏差（RMSD）波动稳定（平均4.7 Å），其吲哚环与Leu425、Val1034形成π-π堆积，苯基与Trp382、Phe614等活性位点氨基酸通过π-π堆积和疏水作用结合，其中Trp381等关键残基参与底物识别，揭示了其高抑制活性的结构基础。相比之下，4c和3ac复合物RMSD波动更大（分别为7.6 Å和8.3 Å），动态稳定性较低，二者通过水桥、特异性π-π堆积等模式与PLD1相互作用，但缺乏与核心活性位点氨基酸的直接作用。模拟结果表明，3r通过多靶点疏水相互作用和π-π堆积实现了对PLD1活性位点的稳定结合，而4c和3ac的结合模式可能受构象动态变化影响，导致活性与结合能不完全匹配。该研究为理解PLD抑制剂的构效关系提供了动态视角，强调活性位点关键残基的相互作用对抑制剂效能的决定性作用。
研究显示，合成的化合物3r、4c和3ac均与PLD1形成稳定平衡复合物。其中，4c与PLD1的相互作用受其二羟基基团氢键显著影响，3r与PLD1的作用模式与已知抑制剂关键作用模式相似，3ac则采用不同对接模式。动态参数表明，3r、4c、3ac的平均rGyr值分别为5.1 Å、4.4 Å和4.7 Å，平均MolSA分别为338 Å2、260 Å2和308 Å2，平均SASA值分别为116 Å2、71 Å2和124 Å2，PSA值分别为76 Å2、166 Å2和64 Å2。SASA的较大标准差反映PLD1结合位点内存在动态水介导的相互作用，而PSA值稳定提示SASA波动主要由非极性原子结构贡献。
3r抑制PLD1的结合残基鉴定
通过药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验证实，化合物3r可通过诱导PLD1构象稳定化增强其对链霉蛋白酶的抗性（图5A）。结合分子动力学模拟结果，对PLD1中潜在结合残基L425、F614、F789进行突变分析发现，F614A和F789A突变可完全消除3r对PLD1活性的抑制作用，而L425A突变无显著影响（图5B），表明F614和F789是3r与PLD1相互作用的关键残基。功能验证显示，3r选择性抑制PLD1过表达细胞中的PLD活性（IC50 = 1.97 μM），而对PLD2无作用（图5C-D）。研究明确了3r通过靶向PLD1的F614和F789残基实现特异性抑制的分子机制，为PLD1选择性抑制剂的设计提供了直接实验依据。
A549和HCT116细胞中IC50值与细胞毒性的比较分析
通过WST-1法评估化合物3r、4c、3ac对A549肺癌细胞和HCT116结直肠癌细胞的细胞毒性及PLD抑制活性显示：在A549细胞中，3r的细胞活力IC50为18 μM，显著优于4c（>200 μM）和3ac（50 μM），其PLD抑制IC50为1.974 μM，较已报道抑制剂VU0155069（2.499 μM）更强。HCT116细胞中，3r的细胞活力IC50为29 μM，而VU0155069对该细胞的毒性更强（IC50 = 20.92 μM）。在肺癌细胞（A549、Calu6）中，3r与VU0155069的细胞活力抑制效果相近（IC50为18–21 μM），但3r对PLD酶活性的抑制更具优势。研究结果表明，3r在肺癌模型中展现出比VU0155069更优的PLD抑制选择性和酶活性抑制效力，且保留了相当的细胞毒性，为靶向PLD1的肺癌治疗提供了更具潜力的候选化合物。
3r对肺癌细胞致癌特性的抑制作用
化合物3r对A549、HCC44、H460、HCC15等多种肺癌细胞均表现出细胞毒性（IC50值相近），并通过时间依赖性方式抑制A549细胞增殖、促进细胞死亡。功能研究显示，3r可显著降低A549细胞的集落形成能力、Ki67阳性增殖率及迁移侵袭能力，并通过流式细胞术和caspase-3活性检测证实其诱导细胞凋亡的作用。研究结果表明，3r能多维度抑制肺癌细胞的致癌特性，展现出明确的抗肿瘤活性。
肺癌中致癌信号与免疫逃逸机制的调控
研究探讨了化合物3r对肺癌中致癌信号通路和免疫逃逸机制的调控作用。EGFR和KRAS激活突变是肺癌的关键致癌因素，PLD1上调与突变型H-RAS诱导的肿瘤发生相关，并影响p-ERK和RAS表达。3r可显著降低磷酸化Akt、ERK和IκBα水平，抑制KRAS转染细胞中的KRAS激活，表明其通过抑制PLD1阻断EGFR-RAS介导的有丝分裂通路。KRAS突变癌细胞高表达“别吃我”信号（CD24、CD47、PD-L1），低表达“吃我”信号（CRT），抑制巨噬细胞吞噬。TCGA数据库分析显示，肺癌中KRAS表达与PLD1、PD-L1呈正相关，与CRT呈负相关。3r处理A549细胞可下调“别吃我”信号，上调“吃我”信号，并增强THP-1来源巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。研究表明，3r通过调控“别吃我/吃我”信号平衡，逆转肿瘤免疫逃逸，兼具抑制致癌信号和激活免疫监视的双重作用，为肺癌治疗提供了新方向。
3r与吉西他滨联合用药增强抑制肺癌细胞增殖及促凋亡作用
研究评估了化合物3r与临床抗癌药物吉西他滨的联合抗肺癌效应。实时成像、荧光分析及凋亡检测（流式细胞术、caspase-3活性等）显示，与单药相比，联合用药显著抑制A549细胞增殖并诱导凋亡（图8A-D）。Synergyfinder分析证实两者具有协同效应（A549细胞Bliss δ评分20.06）（图8E）。机制上，3r通过抑制PLD1阻断致癌信号通路并逆转免疫逃逸，与吉西他滨联用可产生“直接杀伤+免疫激活”的双重协同作用，且能通过降低单药剂量减少副作用。研究结果为PLD1抑制剂联合传统化疗药物在肺癌治疗中的应用提供了实验依据，提示联合疗法可能成为克服肿瘤耐药、提升疗效的新策略。
3r的体内抗肿瘤效应
在体内研究中，化合物3r在C57BL/6小鼠肺癌模型中表现出显著抗肿瘤活性：口服给药可抑制肿瘤形成（图9A-B），且对正常小鼠体重无影响，显示选择性杀伤癌细胞的特性。免疫组化分析表明，3r可减少Ki67阳性增殖细胞、增强caspase-3介导的凋亡（图9C），并抑制RAS通路下游分子p-ERK、p-Akt等的激活（图9D）。机制上，3r通过双重途径发挥作用：①免疫调节效应：下调肿瘤细胞“别吃我”信号（CD47/CD24/PD-L1），上调“吃我”信号（钙网蛋白），同时重塑肿瘤微环境——增加促炎M1巨噬细胞（CD80+）和细胞毒性CD8+ T细胞比例，减少抗炎M2巨噬细胞（CD163+）和调节性T细胞（Treg）（图9E-G）；②非免疫依赖效应：在免疫缺陷裸鼠模型中，3r仍能抑制肿瘤生长、诱导凋亡并阻断RAS通路（图S10D-G），提示其直接杀伤肿瘤细胞的作用。ADME评估显示，3r在人肝微粒体和血浆中稳定性良好（30分钟保留率分别为57.3%和97.4%），支持其体内成药潜力。研究证实，3r通过免疫激活与直接杀伤的双重机制发挥抗肿瘤作用，为PLD1靶向药物在肺癌治疗中的应用提供了体内实验依据。
总结
本研究通过计算机模拟、酶活性测定及构效关系分析，设计合成32种吲哚基PLD抑制剂，筛选出高效PLD1抑制剂3r。分子动力学模拟显示，3r通过与PLD1活性位点关键氨基酸（如F614、F789）结合抑制酶活性（IC50 =1.97 μM），优于对照药物VU0155069（IC50 = 2.50 μM）。体外实验表明，3r对肺癌细胞（如A549）的增殖、迁移和凋亡具有显著调控作用，细胞毒性IC50为18-19 μM，且对肺癌细胞选择性优于结直肠癌细胞。机制上，3r可阻断RAS通路下游分子（p-Akt、p-ERK）激活，下调肿瘤细胞“别吃我”信号（CD47/CD24/PD-L1），上调“吃我”信号（钙网蛋白），增强巨噬细胞吞噬功能，并调节免疫细胞比例（增加促炎M1巨噬细胞和CD8⁺ T细胞，减少抗炎M2巨噬细胞和调节性T细胞）。体内实验显示，3r在荷瘤小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，在免疫缺陷小鼠中仍具抗肿瘤活性，且与吉西他滨联用具有协同效应（Bliss δ评分=20.06）。ADME分析显示，3r在人肝微粒体和血浆中稳定性良好（30分钟保留率分别为57.3%和97.4%）。研究证实3r通过“信号抑制-免疫激活”双重机制发挥抗肿瘤作用，为PLD1靶向药物在肺癌治疗中的应用提供了实验依据。
文献来源
10.1021/acs.jmedchem.4c00750
来源：药渡数据库
