摘要：将治疗药物靶向输送至内脏器官，例如促进愈合或凋亡，在多种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。目前，主流的输送方式依赖于血液循环；然而，这种方式在效率、安全性和/或可控性方面存在显著的局限性。
无电池纳米流体细胞内输送贴片！
将治疗药物靶向输送至内脏器官，例如促进愈合或凋亡，在多种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。目前，主流的输送方式依赖于血液循环；然而，这种方式在效率、安全性和/或可控性方面存在显著的局限性。
鉴于此，北京航空航天大学常凌乾教授、北京大学李默教授、伊利诺伊大学香槟分校Cunjiang Yu，香港城市大学于欣格教授报道了一种无电池、无芯片、柔性纳米流体细胞内输送(NanoFLUID)贴片，该贴片可在目标内脏器官中提供增强型和定制化的有效载荷输送。无芯片架构和薄功能层的柔性特性有利于与内脏器官的整合。纳米孔-微通道-微电极结构能够安全、高效、精确地对细胞膜进行电穿孔，与传统的扩散方法相比，这使其在相对低振幅脉冲(20V)下操作时，细胞内有效载荷的运输速度提高了约105倍。通过在多种体内场景中评估NanoFLUID贴片，包括治疗乳腺肿瘤和肝脏急性损伤以及模拟肿瘤发展，研究人员验证了其在器官靶向输送方面的效率、安全性和可控性。NanoFLUID介导的基因库体内转染也能够有效筛选乳腺癌在肺和肝转移的关键驱动因素。通过这种方法，DUS2被鉴定为肺特异性转移驱动因素。因此，NanoFLUID代表了一个创新的生物电子平台，可将有效载荷定向递送至内脏器官，以治疗各种疾病并揭示生物学的新见解。相关研究成果以题为“A battery-free nanofluidic intracellular delivery patch for internal organs”发表在最新一期《nature》上，共同第一作者为北航Dedong Yin, 北医三院Pan Wang, 西工大Yongcun Hao, 蚌埠医科大学Wei Yue和北航Xinran Jiang。
【NanoFLUID设计与表征】
作者在一张厚度 50 µm、直径 10 mm、质量不足20 mg 的聚萘二酸乙二醇酯薄片上集成了一种完全柔性、无需电池的“纳流体细胞内递送贴片”，能够贴合小鼠乳腺或肝脏等轻微曲面的器官而不影响其运动 。递送侧采用“纳米孔-微通道-微电极”三层结构：600 nm 孔径的聚碳酸酯膜、微通道储液器以及金微电极阵列。有限元模拟显示，纳米孔可将外加电场集中至约 1.5 × 106V m⁻¹，使电泳驱动的货物传输速率较纯扩散提高约 105倍，而所用脉冲仅为方波 20 V、10 Hz、20 ms。背面线圈与齐纳二极管整流器可在 12 MHz 射频载波下收能，输出 20 V（体外/肝脏实验）或 50 V（较厚组织），且在 3–5 cm 组织距离或 60° 静态弯折条件下电压保持稳定，后者亦是器件的疲劳极限。图 1展示了器件贴附于器官表面的整体照片（a/b），三层结构示意（c/d），纳米孔电穿孔原理图（e）以及无线产生的 50 V 脉冲序列（g）。图 1 . 用于在体内器官内进行输送的无电池 NanoFLUID 装置
【NanoFLUID 体外共转染效能】
在三种难转染细胞（MCF-7、人间充质干细胞MSC、鼠主动脉内皮细胞RAEC）中，优化方案（20V、20ms、2脉冲）可获得>90%GFP阳性率，而脂质体法为65–75%，商用体积电转化仪则。一次性递送四种荧光质粒时，NanoFLUID处理细胞中约50%同时表达四个基因；脂质体法仅9.4%，体积电转仅0.8%。电穿孔亦将细胞外囊泡（EV）释放量提升至近3×109EV ml⁻¹，比对照高约十倍，其中约一半EV封装了转染的mRNA/蛋白，可实现旁观者细胞的二次转染。图2示意转染流程（a）、单基因效率柱状图（b）、四色阳性单细胞（c）、RT-PCR结果（d）、多基因表达分布（e–g）、EV产量（h）及EV-介导的二次转染（i/j）。对于安全性与整体体内效能，贴片植入于第四乳腺皮下21天无肉眼炎症反应，局部细胞因子水平正常，全血计数及血清生化亦未见异常；LPS处理组作阳性对照。在肝脏实验中，20V脉冲可使约6%肝细胞转染而不升高ALT/AST，说明低场强足以避免深层组织损伤。远隔器官几乎未检测到非特异性荧光，与系统性病毒或脂质体递送相比显著降低。图 2 . NanoFLUID 增强体外多种基因的转染
【NanoFLUID急性肝损伤治疗】
在小鼠肝裂伤模型中，比较5种处理：空白、GelMA水凝胶、系统性脂质体-EGF、GelMA+EGF及NanoFLUID+EGF（质粒2mgkg⁻¹）。NanoFLUID可即时止血并在7天内实现100%生存率，空白对照为60%，脂质体组70%。仅NanoFLUID-EGF与水凝胶-EGF组在第7天将ALT/AST恢复至基线。组织学显示肝实质平滑、Masson染色几乎无胶原沉积，Suzuki坏死评分平均0.2（其他组1.5–4.0）。图3汇总实验时间轴（a）、Kaplan-Meier生存曲线（b）、肝功能曲线（c/d）、H&E与Masson切片（e）、纤维化定量（f）及Suzuki评分（g）。
图 3 . NanoFLUID 在急性创伤性肝损伤治疗中的应用
【NanoFLUID 原位乳腺肿瘤建模】
两次递送CRISPR/Cas9质粒敲除Brca1与Trp53：周1流式检测3%Brca1-KO、21%Trp53-KO、68%双KO细胞。光片显微定位表明GFP⁺前癌克隆遍布2.5mm厚腺体（b）。中位肿瘤潜伏期53周；15例NanoFLUID小鼠中6例出现可触癌，而静脉脂质体仅2/15（P=2.4×10⁻⁵）。彗星实验显示双链断裂增加九倍，全基因组测序检出7600处显著拷贝数变异，接近人BRCA1突变乳腺癌的8300处，远高于传统胚系GEMM的3311处。图4给出单细胞KO分布（a）、3-D定位（b）、无瘤生存曲线（c）、IVIS成像（d）、组织学与γH2AX染色（e/f）、彗星定量（g）及基因组对比（h–j）。
图 4 . NanoFLUID 体内转染产生原发性乳腺肿瘤
【NanoFLUID 原位乳腺肿瘤治疗】
对 ~70 mm³ 的 E0771 Brca1/Trp53-KO 肿瘤，连续 3 周递送 FITC-尼拉帕利：口服灌胃（50 mg kg⁻¹ d⁻¹）、单次肿瘤内注射、可降解缓释膜（45 µg）或NanoFLUID （6 × 10⁴ ng g⁻¹，每 3 天一次）。10 min 内 NanoFLUID 使 ~35 % 肿瘤细胞含药，而肿瘤内注射仅 ~12 %，口服/缓释膜 图 5展示方案（a）、快速摄取动力学（b/c）、肿瘤生长曲线（d）与质量（e）、凋亡/增殖标记（f）、安全性指标（g–j）。
图 5 . NanoFLUID 输送用于原位乳腺肿瘤治疗
NanoFLUID 转移驱动基因筛选
利用其高共转染能力，在可诱导 PyVmT 小鼠原位递送含GFP 的 50 个不良预后基因 piggy-Bac 文库。1 周时所有基因仅见于乳腺细胞，肺/肝均为阴性，说明空间控制精准 。第 9 周 7/8 文库小鼠出现转移（肺6 例，肝 5 例），空载组至 12 周仍 0/8 。对转移灶 PCR/qPCR 揭示 11 个富集基因，其中 DUS2 最高，TPM 4 030，5/8单细胞基因组检出 。单独过表达 DUS2 使转移结节数翻倍，同时敲低（人/鼠 shRNA）将结节降低 > 60 %（P = 0.037） 。蛋白质组学表明 DUS2 上调 76 种参与Rho-GTPase 信号、黏附斑及上皮-间质转化的蛋白，推动侵袭 。图 6包括筛选流程（a）、基因存在热图（b）、单细胞多基因装载（c）、无转移生存曲线（d）、IVIS/H&E 示范（e/f）、结节计数（g）、富集热图（h/i）、转译实验（j–m）及 DUS2 功能增/减实验（o–r）。
图 6 . 通过 NanoFLUID 介导的基因库传递筛选乳腺癌转移驱动基因
【总结】
通过巧妙的“纳米孔-微流体-微电子”架构，NanoFLUID能以20–50V无线脉冲在活体器官实质中原位穿孔并电泳推进带电货物，实现亚毫米级精准递送。平台在体外可获得>90%多基因转染效率，体内可止血并修复致命肝裂伤，构建基因组特征贴近人病的BRCA1/TP53-突变原位肿瘤，并在PARP-抑制剂递送中优于系统或被动局部疗法而无全身毒性。其一次可并行递送50种质粒，10周内成功筛出肺特异性转移驱动基因DUS2。综上，NanoFLUID是一种多功能生物电子贴片，适用于器官定点治疗、疾病模型构建及高通量体内基因学研究，有望解决深部、脆弱或难切除组织的多类棘手病症。
来源：高分子科学前沿一点号1