摘要：植物世界中隐藏着无数天然药物的宝藏，其中松香烷型二萜（Abietane-type diterpenoids）因其独特的结构和多样的生物活性备受关注。这类化合物包括抗氧化的鼠尾草酚（carnosic acid）、抗肿瘤的丹参酮（tanshinones），以及临床
植物世界中隐藏着无数天然药物的宝藏，其中松香烷型二萜（Abietane-type diterpenoids）因其独特的结构和多样的生物活性备受关注。这类化合物包括抗氧化的鼠尾草酚（carnosic acid）、抗肿瘤的丹参酮（tanshinones），以及临床用于治疗胰腺癌的雷公藤内酯衍生物（如 mimelide），但它们大多依赖从药用植物中提取，耗时耗力且成本高昂。
作为这类化合物的核心前体，次丹参酮二烯（miltiradiene）的合成效率直接影响下游药物的开发进程。2009 年，中国工程院黄璐琦院士团队首次在药用植物丹参中解析了 miltiradiene 的生物合成路径，揭示了其由香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）经两步酶催化生成的过程，为后续微生物异源合成奠定了基础。然而，如何通过工程化手段在微生物中实现高效生产，始终是合成生物学领域的重大挑战。
近日，天津大学乔建军教授团队在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 发表突破性研究题为“Efficient Biosynthesis of the Plant-Derived Diterpenoid Miltiradiene in Saccharomyces cerevisiae”，通过代谢工程与酶工程的协同创新，在酿酒酵母中实现了 miltiradiene 的高效合成。该团队不仅将产量提升至 6.4 g/L，刷新了该领域的全球纪录，更构建了一套“代谢优化-酶设计-产物外排”的全链条解决方案，为植物天然产物的工业化生产提供了全新范式。
在酿酒酵母中，萜类化合物的合成依赖甲羟戊酸（MVA）途径，其核心挑战在于如何将碳代谢流定向输送至目标产物。研究团队以 BY4741 菌株为底盘，通过过表达 MVA 途径的限速酶 tHMG1、ERG20 等基因，他们成功将前体 GGPP 的产量提升了数倍。然而，初期工程菌的 miltiradiene 产量仅为 7.1 mg/L，问题出在合成酶的效率上，植物来源的二萜合酶在酵母中活性低下。为此，团队从丹参、毛喉鞘蕊花等植物中筛选了 20 组酶组合，最终发现来自碎米桠（Isodon rubescens）的 IrCPS1 和 IrKSL1 组合效果最佳，产量提升至 10.6 mg/L。
天然酶在异源宿主中的低活性是行业共性难题。团队决定进行半理性设计，对 IrCPS1 和 IrKSL1 进行定点诱变的精准改造。他们通过多序列比对分析了 41 个潜在突变位点，最终锁定四个关键位点：将 IrCPS1 的 251 号天冬酰胺变为赖氨酸（N251K）、482 号甲硫氨酸变为亮氨酸（M482L），同时将 IrKSL1 的 504 号天冬酰胺变为苏氨酸（N504T）、518号酪氨酸变为半胱氨酸（Y518C）。这些调整让酶的活性显著提升。改造后的工程菌产量提升至 21.2 mg/L，较原始酶组合翻了一番。
图 | 分子动力学模拟显示，突变通过优化底物通道的疏水性及酶结构稳定性间接提升了催化效率
酶的优化并未止步于此。植物酶的 N 端通常携带靶向细胞器的转运肽，但这些序列在酵母中可能阻碍功能表达。团队通过截短 IrCPS1 和 IrKSL1 的 N 端 60 和 30 个氨基酸，酶的活性进一步提升，产量达到 34.6 mg/L。为进一步缩短底物传递距离，团队将两种酶通过刚性连接肽(PT)4P 串联为融合蛋白，并引入 SKIK 标签增强表达稳定性。这一系列操作使催化效率再上新台阶，最终产量飙升至 297.8 mg/L，较初始菌株提升近 40 倍。
乙酰辅酶 A 是 MVA 途径的起点，但其胞内浓度常成为限速因素。团队采用三路并进策略：一是过表达乙酰辅酶 A 合成酶 ACS1，强化“PDH 旁路”途径；二是引入无线粒体定位的丙酮酸脱氢酶（cytoPDH），直接在细胞质中生成乙酰辅酶 A；三是优化乙醇代谢，减少碳源浪费。三重调控下，乙酰辅酶 A 通量显著提升，且细胞生长未受显著抑制，证明代谢网络实现了动态平衡。
图 | 通过异源 PDH 旁路、细胞质 PDH 及 YlACL 等多策略协同增强乙酰辅酶 A 供应，miltiradiene 产量显著提升
随着产量攀升，高浓度产物积累易引发细胞毒性。团队将目光投向转运系统，试图让酵母“主动外排”产物。团队筛选了酵母内源性 ABC 转运蛋白家族，发现过表达 PDR10 后，miltiradiene 的外排比例从 34.9% 提升至 47.2%，总产量稳定在 649.3 mg/L。这一发现不仅缓解了产物毒性，还为后续分离纯化降低了难度，发酵液中近一半的产物已自动进入十二烷萃取相，大幅简化了下游工艺。
最终，团队在 5 L 发酵罐中验证了规模化生产的可行性。通过两阶段补料策略，前期快速增殖生物量，后期诱导合成并捕获产物，工程菌在 72 小时内将产量推至 6.4 g/L，较此前报道的最高值（3.5 g/L）提升近一倍，展现了工业化应用的巨大潜力。
这项研究的突破不仅在于产量数字的刷新，更在于方法论的系统性创新。从代谢路径的精细调控、酶分子的理性设计，到产物外排的智能管理，团队构建了一套可复制的技术框架。未来，这一平台有望扩展到丹参酮、雷公藤内酯等高价值药物的全程合成。目前，研究团队已着手解析下游 P450 氧化酶的功能——这些酶负责将 miltiradiene 转化为具有特定药效的衍生物。若能攻克这一难关，微生物工厂“从原料到药物”的全链条生产将成为可能，彻底改变药用二萜依赖植物提取的现状。或许在不远的未来，救命药物的生产将不再受制于植物的生长周期，而是在微生物的精密调控中高效诞生。
参考链接：
1.Chen R, Wang S, Nie S, et al. Efficient biosynthesis of the plant-derived diterpenoid miltiradiene in Saccharomyces cerevisiae.[J]ACS Sustainable Chemistry & Engineering.(2025).DOI: 10.1021/acssuschemeng.5c00924
免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
来源：生辉SciPhi