德克萨斯大学奥斯汀分校刘鸿文教授代表性工作概览

摘要：刘鸿文（Hung-wen (Ben) Liu）教授，任教于德克萨斯大学奥斯汀分校（UT Austin）药学院和理学院的化学系，担任乔治希钦斯药物设计讲席教授。研究兴趣主要在于自然界中次级代谢物的生物合成途径和其中酶促反应所牵涉的化学机理。他的研究工作揭示了酶催

个人简介

刘鸿文（Hung-wen (Ben) Liu）教授，任教于德克萨斯大学奥斯汀分校（UT Austin）药学院和理学院的化学系，担任乔治希钦斯药物设计讲席教授。研究兴趣主要在于自然界中次级代谢物的生物合成途径和其中酶促反应所牵涉的化学机理。他的研究工作揭示了酶催化反应中许多微妙但普适的原则，为以酶催化为核心手段的现代药物发现和开发奠定了重要基础。

刘鸿文教授。图片来源：UT Austin

从历史爱好者到化学研究工作者

刘鸿文教授出生于中国台湾，早年求学过程中虽对历史充满兴趣，但在家人的建议下选择了化学作为主修专业。这一决定改变了他的人生轨迹。在东海大学求学期间，他遇到了多位学有专长又乐于教学的化学教授，尤其是Lewis Fikes博士，激发了他对有机化学的浓厚兴趣，从此有机化学成为贯穿他整个职业生涯的研究主题和手段。更重要的是，他在东海大学结识了他的妻子贾咏南，当时她是一名生物学专业的学生，后来在纽约西奈山医学院取得微生物学的博士学位，之后在哈佛医学院免疫系做博后研究。她是刘教授一生最可靠的支柱，也是他最有力的帮手。

刘教授于1976年前往美国深造，在哥伦比亚大学师从Koji Nakanishi（中西香尔）教授攻读博士学位。Nakanishi教授是国际著名的天然产物化学专家。在研究生期间，刘教授研究了东非药用植物中生物活性化合物的分离和结构表征，并参与开发了一种基于圆二色谱激子手性原理的微量分析方法，用于确定天然产物的糖苷键。在Nakanishi教授实验室的研究经历激发了刘教授对生化反应中复杂却不失优雅之处的欣赏。深受Nakanishi教授的影响，刘教授在此后超过四十年的研究生涯中持续怀以热情和严谨的态度对待每一个科研难题。Nakanishi教授不仅是刘教授的导师也是他终身的朋友，直到Nakanishi教授在2019年逝世。

随后，刘教授在麻省理工学院的Christopher Walsh教授实验室进行博士后研究。Walsh教授被誉为化学生物学的巨匠。在Walsh教授的指导下，刘教授研究了1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶的化学机制。这是一种依赖于磷酸吡哆醛（PLP）的酶，催化ACC的环丙烷开环反应。这一经历激发了刘教授对复杂生物合成系统的兴趣，使他获得了生物化学的研究训练，并帮助他确立了具有自身识别度的研究领域。Walsh教授一直是刘教授的榜样，直到Walsh教授于2023年过世。1984年，刘教授在明尼苏达大学开始了独立科研生涯。2000年受聘于德克萨斯大学奥斯汀分校药学院和理学院的化学系至今。

开创脱氧糖生物合成研究新领域

在刘教授建立团队之初，他提出了一个简单却极具挑战性的问题：自然界如何构建脱氧糖？彼时这一领域鲜有人注意。这一方面归因于分离获得足够量的酶是一件很棘手的事，另一方面，当时的科学界认为这只是一个缺乏实际用途的基础科学问题。但刘教授敏锐地意识糖类分子在生物反应、细胞识别以及免疫反应中的重要性，同时也看到了分子生物学将在化学领域中发挥重要的作用。因此他断然决定以此课题作为他的研究目标，同时也成为了最早一批将分子生物学与有机合成相结合的化学家。

随后，刘教授和他的团队成功克隆了Yersinia 菌中的3,6-双脱氧己糖——抗坏血酸糖的生物合成所需的六个基因，并结合有机合成的方法揭示了这些酶的催化机制。这一课题拉开了刘教授课题组此后四十余年对于酶催化机制研究的序幕，也为人们如何研究脱氧糖生物合成的酶以及一般的次级代谢酶建立了崭新的范例 (Annu. Rev. Biochem. 2002, 71, 701-754)。刘教授表征了多种脱氧糖的生物合成途径，包括帕拉糖（paratose）、泰维糖（tyvelose）、耶尔森糖（yersiniose）、可立糖（colitose）、地高辛糖（digitoxose）、麦卡糖（mycarose）、麦卡胺糖（mycaminose）、脱氧糖胺（desosamine）和福洛糖胺（forosamine）（图1）。

图1. 一些特异单糖生物合成的例子

尽管当时并不明显，但这些研究最终为生物技术领域的糖多样化转化奠定了重要基础。随着对天然产物生物学的深入了解，人们发现糖的化学结构对其生物活性有关键性影响，例如带有脱氧糖的临床重要抗生素红霉素。因此随着抗生素耐药性细菌的出现，刘教授在该领域的研究成果变得尤为重要。目前人们对于通过糖多样化生成新的大环内酯类抗生素产生了浓厚兴趣，相关的研究包括以引入自然界中不存在的糖部分的方式来克服耐药性问题。

认识到这一点后，刘教授将大量精力集中在糖基转移酶的机制研究上，他的研究在这一领域具有颠覆性的意义，因为它改变了人们对糖基转移酶在聚酮抗生素生物合成中作用的认识。刘教授证明，胺糖基转移酶需要一个第二亚基，而这一亚基此前被领域内的其他研究者忽视 (J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 6534-6535) 。他的实验室首次在体外实现了大环内酯糖基化酶促反应，并发现一些聚酮糖基转移酶对底物的结构变化具有很高的灵活性。他的工作开辟了一个新领域，人们可以通过操纵生物合成机制来生成多样糖基化化合物并用于新型抗生素的筛选 (Pure Appl. Chem. 2007, 79, 785-799; Biochemistry, 2008, 47, 6329-6341)。因此，刘教授的发现将天然产物研究提升到了一个新的水平，他的实验室被广泛认为是当前非典型糖生物合成研究的奠基者。

在这些研究中，刘教授在脱氧糖生物合成酶学领域做出了四项突出贡献。首先，他首次证明了多酶电子传递途径和自由基化学是抗坏血酸糖C-3脱氧的基础 (Chem. Rev.2000, 100, 4615-4661)。其次，他首次展示了PLP可以参与自由基中间体的形成，而此前其仅被认为在酶促反应中参与基团的转移 (J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4239-4240) 。第三，他确立了L-麦卡糖和福洛糖胺生物合成过程中C-2脱氧的机制。最后，他发现脱氧糖胺C-4脱氧的机制是依赖于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的自由基介导过程进行的 (Israel. J. Chem. 2015, 55, 315-324) 。这一机制的细节仍在揭示中，且非常引人入胜。这些研究共同确立了己糖脱氧的位置特异性机制，展示了酶催化C-O键断裂的多样性。

自由基酶学的开拓者

除了脱氧糖的机制研究，刘教授还是自由基酶学机制的专家。他研究了多种依赖自由基反应的酶，包括在磷霉素生物合成过程中催化环氧化反应的单核非血红素铁依赖酶(S)-2-羟丙基膦酸酯环氧化酶HppE以及在脱氧糖胺生物合成中催化脱氨反应的自由基SAM酶DesII。最近，他的团队展开了关于维生素B12依赖性的自由基SAM酶的机制研究。这类极不寻常的酶在次级代谢物的生物合成中催化非活化碳中心的多种反应 (Biochemistry, 2024, 63, 3161-3183)。尽管研究这些酶面临不小的挑战，刘教授的实验室近年在表征庆大霉素（gentamicin）生物合成中的甲基转移酶GenK以及催化奥西他诺辛（oxetanocin）生物合成中的氧化环收缩的OxsB酶方面取得了显著进展。这些研究为理解高活性自由基中间体如何在酶活性位点内产生与淬灭提供了关键见解。

刘教授对自由基化学的兴趣还促使他研究了黄素在糖和萜类化合物异构化中的作用。刘教授发现了过去从未被认识到的黄素新作用——作为酸碱催化剂。此后，黄素的酸碱催化作用在多种其他生物合成反应中被发现，包括质子引发异戊二烯环化反应。他对机制酶学领域的其他贡献还包括阐明了氮丙环形成的机制（如阿齐斯霉素，azicemicins）以及硫糖部分中硫掺入的机制（抗生素BE-7585A）。然而，最引人注目的是他对昆虫杀虫剂多杀菌素A（spinosyn A）生物合成过程中的 [4+2]-碳环化酶的研究。二十多年来，全球范围内一直在寻找能够催化生物Diels-Alder反应的酶，但文献中报道的仅能支持酶催化底物的活化，而酶是否参与环化本身并不明朗。在一篇被高频引用的Nature 论文中 (Nature 2011, 473, 109-112) ，刘教授证明了SpnF是一种独立的环化酶，能够将电环化反应加速500倍。这个研究还促使了首个催化Rauhut-Currier反应的酶的发现 (J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 20291-20295) 。

刘教授的科研成果赢得了国际学术界的高度认可，其重要性和影响力体现在300多篇论文中，主要发表于Journal of the American Chemical Society、Angewandte Chemie、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、Science 和 Nature等顶级期刊上。他是美国化学会多项奖项的得主，包括Horace S. Isbell Award，Claude S. Hudson Award，Nakanishi Prize，Repligen Award，Arthur C. Cope Late Career Scholar Award和A. I. Scott Medal。2022年诺曼·R·法恩斯沃思ASP研究成就奖（Norman R. Farnsworth ASP Research Achievement Award）是对他过去四十载科研生涯的充分肯定，也是对他在天然产物化学领域的创造性贡献的高度赞誉。

刘教授不仅是一位杰出的科学家，也是一位优秀的导师。他的实验室是未来科学家的摇篮，培养了近120名科研人员，其中许多人后来在学术界和工业界取得了卓越成就。他还担任多家期刊的编委，并曾担任Organic Letters 的副主编长达16年，处理了大部分与天然产物化学相关的手稿。刘教授是2010年和2020年出版的Comprehensive Natural Products: Chemistry and Biology 的两名主编之一。在这一角色中，他在促进化学与生物学交叉领域的研究方面发挥了关键作用。刘鸿文教授以其卓越的科研成就和高尚的人格魅力赢得了同行们的尊敬。他的研究不仅推动了天然产物化学的发展，也为应对全球健康挑战提供了新的思路。

刘鸿文教授课题组近年来在X-MOL上报道过的代表性成果

（一）C-核苷天然产物恶嗪霉素的生物合成

C-核苷是呋喃糖与碱基以碳碳键相连的一类化合物，相比于常见的N-核苷，C-核苷具有更高的抗降解代谢的稳定性。许多C-核苷可以代替N-核苷并参与到核糖核酸的合成中，因而具有抗菌等生物活性。恶嗪霉素（oxazinomycin，1）是一种C-核苷天然产物，具有抗菌以及抗肿瘤活性。刘教授课题组成功实现了恶嗪霉素全生物合成的体外重组，并深入研究了酶催化的C-糖苷键与恶嗪环的形成机制。

研究人员推测ozm基因簇中的C-糖苷酶OzmB可能催化呋喃糖酸与吡啶衍生物（2）间的耦合（图2）。然而，此富电的吡啶衍生物（2, 图2）在中性有氧的环境下不稳定，研究人员化学合成了较为稳定的吡啶盐酸盐并且在无氧的条件下进行糖苷化的酶催化反应。当反应产物接触到空气时会由无色变为蓝色，并产生二聚物靛蓝（indochrom）的质谱讯号。研究人员因此认定C-糖苷酶OzmB的催化产物为富电的C-吡啶衍生物核苷(3，图2），只因其极易自发氧化而无法被直接表征。进一步的研究证实C-糖苷化的机理是经由酶的甘胺酸残基与呋喃糖酸形成活化的席夫碱中间体，进而被吡啶衍生物亲核进攻形成碳碳键。

图2. C-糖苷键的形成

恶嗪霉素的生物合成中最重要的一步是吡啶环向恶嗪环的氧化重排过程（3 → 1，图3）。研究显示该反应的副产物是氰根离子，并通过同位素示踪法揭示了氰根离子源于底物的三号位碳及其相连的氮，而被引入恶嗪环中的氧原子来自氧气而并非水。OzmD是属于未知的DUF4243蛋白家族，从光谱分析、滴定实验及完整蛋白质谱证实OzmD属于非血红素类型的单铁蛋白，并且铁是酶催化的必要因子。结合同位素示踪结果，研究人员提出了可能的吡啶环向恶嗪环转化的铁催化氧化重排的机理（图3）（J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 24, 10968–10977）。

图3. 推测的氧化重排机理

（二）含有环氧异氰基团的抗生素的生物合成

气氰菌素（aerocyanidin, 1, 图4）和环氧异氰霉素（amycomicin, 2, 图4）是两种长链脂肪酸衍生的抗生素。由于它们的结构中所含有的环氧异氰基十分活泼，这类天然物的全合成极富挑战性，环氧异氰的生物合成机制也还没有被报道过。刘鸿文教授课题组和哈佛医学院的Jon Clardy教授合作，成功揭示了气氰菌素和环氧异氰霉素的生物合成途径。

图4. 气氰菌素和环氧异氰霉素生物合成途径的总结

气氰菌素和环氧异氰霉素的基因簇早前由Clardy教授课题组发现。研究人员发现化合物1和2中的异氰基团是经由甘氨酸衍生物的氧化而形成的（3 → 4 → 5，图4），这与一些已报道的异氰化合物相同。紧接着，所生成的异氰化合物会依序被连接到各自的酰基载体蛋白（AecC和AmcE）与聚酮合酶（AecD和AmcF/G）上（5 → 6，图4），从而进行碳链的加长，分别形成化合物7和8（6 → 7/8，图4）。值得一提的是，化合物7和8中的羟基是在聚酮合酶催化的碳链增长过程中形成的，这一发现解释了表面上氧化酶数量不足的问题。

接下来，基因敲除和回补实验证实了1中的环氧基团是由带有cupin结构域的蛋白AecF负责（7 → 1，图4），而2的环氧基团是由一对细胞色素P450酶（AmcB和AmcC）催化形成的。最后，另一个P450酶AmcQ负责修饰化合物2长碳链上的8号位，从而完成2的生物合成（8 → 2，图4）。这项研究不仅提供了可用以预测环氧异氰类天然产物的生物合成信息，还提出了一些新问题，例如环氧异氰类抗生素的生物机理是什么，另外环氧化酶AecF和AmcB/AmcC的催化机理也还有待进一步的探索（J. Am. Chem. Soc.2024, 146, 30, 21061–21068）。

（三）B12依赖性的自由基酶OxsB与AlsB的反应多样性

自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM, 1, 图5）酶因其催化复杂化学反应的能力以及涉及自由基中间体，近年来成为相关领域的热门课题。SAM酶的活性中心包含一个催化型的[Fe4S4]rad参与SAM的还原裂解。而有一类自由基SAM酶同时含有钴胺素（B12）辅因子，且大多数这一类型酶的功能是藉由甲钴胺催化底物的甲基化。刘教授课题组在2017年与2022年分别报导了OxsB和AlsB, 他们在对应的辅助酶（即OxsA和AlsA）参与下，催化脱氧腺苷磷酸（4，图5）缩环反应并产生氧杂环丁烷核苷酸7和8（图5）。

2023年该课题组使用同位素标记的底物或SAM追踪反应，进一步发现OxsB与AlsB还能够催化以4（图5）为底物有序的甲基化（4 → 6 → 9）、碳碳键脱氢（9 → 10→ 11）和自由基介导的碳碳键生成（11 → 12 → 13）（图5）。此外，实验也揭示甲基化的机理始于5′-腺苷自由基攫取C2′ 的pro-R氢原子，产生底物自由基6（图5），此过程与AlsB催化的缩环反应有相同的立体选择性。作者因此推测底物（4，图5）发生缩环或是甲基化的关键取决于B12辅因子是否被甲基化。甲基转移导致底物C2′ 的立体化学发生反转，使原来C2′ 的pro-S氢原子移动到核糖环的另一边，意即可以发生氢原子攫取的位置。甲基化的产物（9，图5）也是OxsB（或者AlsB）仍能接受的底物，然而不同于其他B12依赖性的自由基SAM酶可以在同一修饰位点上进行多次的甲基化，以9为底物产生的自由基中间体（10，图5）没有进行甲基化，而是发生单电子氧化形成甲烯基（11，图5）。虽然11的C2'不再具有氢原子，其仍能被OxsB接受并且引发SAM的还原，导致5′-脱氧腺苷自由基（3）对甲烯基的加成。从9到13的两步化学反应在自由基SAM酶的催化中虽有先例，但在B12依赖性的酶家族中皆是第一次被观察到（图5）。

此研究结果可提供两种思考：第一，相对于路易斯酸碱，自由基酶虽能够活化惰性键并催化复杂的化学反应，高能中间体的生成也容易导致副反应。第二，以演化的观点而言，高能中间体可以在微小的环境差异中导向迥异的催化结果，这或许是自由基SAM酶更易于演化出多样的催化能力的原因之一（J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 6, 3656–3664）。

图5. B12依赖性的自由基酶OxsB与AlsB 催化功能示意图

（四）自由基SAM酶BlsE在杀稻瘟菌素S生物合成过程中催化自由基介导的1,2-二醇脱水反应

BlsE是杀稻瘟菌素S（BLS）生物合成基因簇中的BlsE基因所编码的一个自由基SAM酶。早期研究中，BlsE被表征为SAM自由基脱羧酶，催化胞嘧啶葡萄糖醛酸（CGA）的5'-脱羧反应。然而，终产物杀稻瘟菌素S结构中仍保有5'-羧基，倘若BlsE行使脱羧功能，其结果似乎并不符合生物体内碳流代谢的经济性和高效性。刘鸿文教授课题组与中科院深圳先进技术研究院/中科院上海有机所周佳海研究员、厦门大学王斌举教授以及西北农林科技大学高锦明教授合作，对BlsE的体内功能进行了重新表征，发现该酶实际催化的是脱水反应，但因其产物具有不稳定的β-酮酸结构，而导致在体外反应中观测到的主要为非酶促脱羧后的产物（图6）。

图6. BlsE 酶催化功能图示

在该研究中，作者发现BlsE的催化产物在反应液中较快地转变成CGA结构脱水和脱羧后的结构PPN，通过利用化学还原剂将BlsE产物中不稳定的酮基转换为羟基再加以结构分析，证明了BlsE的催化产物为带有5'-羧基的β-酮酸结构。作者进一步利用同位素标记的底物与氟代的底物替代物，并结合理论计算阐明了BlsE催化脱水反应的详细机制：（1）脱氧腺苷自由基攫取底物CGA中4'-C上的氢原子；（2）4'-羟基的质子转移至3'-羟基使其脱去；（3）产物自由基经由单电子还原淬灭。

BlsE含有两个铁硫簇，属于twitch酶家族，也是此酶家族中唯一已知的裂合酶。作者解析了BlsE的X-射线衍射晶体结构，通过定点突变证实辅助的铁硫簇在催化的过程中是不可或缺的，更加凸显了BlsE与另外两个已知的单铁硫簇裂解酶DesII和AprD4的不同。作者进一步通过对BlsE-SAM二元复合物和BlsE-SAM-CGA三元复合物结构的研究以及分子动力学（MD）的模拟，深入揭示了BlsE催化反应的分子机制（J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 10, 4478–4486）。

（五）自由基SAM酶MybB介导含硫抗生素结核分枝杆菌素的生物合成，展现了初级代谢与次级代谢的相互交融

结核分枝杆菌素（mycobacidin, 1, 图7）是来源于链霉菌的抗生素，具有抑制结核杆菌的活性。其核心结构是含硫的4-噻唑烷酮环，该生物合成过程一直是个未解之谜。刘教授课题组从链霉菌中发现并解析了其生物合成基因簇（myb），发现了硫桥是由一个极其罕见的具有自杀性的自由基SAM酶MybB催化形成，此类反应是第一次在生物次级代谢途径中被发现。此外，他们还发现 myb基因簇是次级代谢物结核分枝杆菌素和初级代谢物生物素（biotin）的双功能基因簇，而分枝杆菌素抑制结核杆菌中的生物素途径（酶促靶标是BioB），这表明该链霉菌中存在一种未知的生物素合成进化机制以助于生物竞争。因此，myb基因簇和 MybB不仅显示了初级代谢和次级代谢之间的交集，而且这两种途径能够在生态层面上相互影响（图7）。

图7. 自由基SAM酶MybB介导结核分枝杆菌素和生物素的生物途径

该课题组推测硫元素最有可能来源于自由基SAM酶，筛选了基因组中所有和氨基转移酶接近的自由基SAM酶，成功筛选到MybB催化8生成1（图8）。进一步推断生物途径可能始于薄桃酸辅酶A或薄桃酸酰基载体蛋白5，在还原性释放为薄桃醛6后，经酶促实验证明MybC进行氨化反应产生7，MybD进行乙酰化反应产生前体8，最后MybB催化硫桥形成1（图8B）。

接着，为了探究MybB酶促反应中硫的来源，该课题组利用Na234S重构的ISCU蛋白（铁硫簇组装支架蛋白）辅助未重构的MybB反应，成功将34S插入了结核分枝杆菌素，证实了硫元素来源于酶的铁硫簇。进一步分析显示硫来源于MybB酶中的[Fe2S2]。最后，为了确认碳硫键的形成顺序，他们合成了32和33 （图8），MybB只催化33产生1，即MybB首先催化C10-S键，再催化C7-S 键形成。化学计量检测同时显示每一分子1的产生需要两分子的SAM参与。结合以上结果，该课题组推测了MybB的催化机制（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 5, 4180–4187）。

图8. 结核分枝杆菌素和生物素生物合成途径的总结

（六）大观霉素生物合成途径中二氧六环的形成

大观霉素（spectinomycin，6）是一种二氧六环桥连的三环氨基糖苷类药物，刘鸿文教授课题组和周佳海研究员团队合作探究了大观霉素生物合成中二氧六环的形成机制。刘教授课题组对其途径提出假设：第一种假设是先形成C2'位羰基再形成糖苷键，推测化合物7和14通过糖基转移酶耦合生成大观霉素（图9A）；另一种假设是先形成糖苷键再形成C2'位羰基生成中间体5，随后发生自发的半缩酮反应生成大观霉素（图9B）。通过酶促反应对(2'S)-21和30的C2'和C3'两个手性碳的四个非对映异构体进行酶促反应，最终确定SpeY催化 (2′R,3′S)-30 C2'羟基发生脱氢反应生成37，随后发生自发的半缩酮反应形成二氧六环 (3′S)-31（图10），并证明SAM裂解产生的5'dAdo•对底物C2'位H的区域选择性。SpeY•SAM•底物的复合物晶体结构显示183位的Sγ/Oγ中心与底物C2'位以及SAM C5'几乎在一条直线上，形成共线矩阵，将其突变成半胱氨酸后，SpeY会转化为相应的C2'羟基异构酶（图10）。

在2021年，刘教授课题组还报道了另一个twitch家族的自由基SAM酶HygY，该酶在潮霉素B的生物合成中催化半乳糖胺C2'位羟基的异构化，当Cys183突变为Ala时，HygY的异构活性转变为脱氢活性。SpeY和HygY这两个酶相互印证，共同说明非氧化还原的异构化反应和脱氢反应之间存在进化关系（J. Am. Chem. Soc.2022, 144, 22, 9910–9919）。