摘要：艰难梭菌是抗生素相关性腹泻的主要原因，其在肠道中的定植受到肠道微生物群的抑制，但具体的机制尚未完全明确。我们通过对12项人类研究的整合分析，重建与艰难梭菌定植呈负相关的微生物网络，设计了一种合成粪菌移植（sFMT1）。这个由实验室构建的包含37种菌株的菌群在体

研究论文

● 期刊：Cell Host & Microbe (IF:20.6)

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● 发表日期：2025-3-12

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亮点Highlight

● 机器学习通过稳健的跨队列信号设计微生物群落

● 合成菌群在体内形成稳定的群落，抑制艰难梭菌

● 分解脯氨酸的菌株对于抑制艰难梭菌是必要且充分的

● 在无菌动物模型中，厌氧普雷沃菌与人类粪菌移植同样有效

摘要Abstract

艰难梭菌是抗生素相关性腹泻的主要原因，其在肠道中的定植受到肠道微生物群的抑制，但具体的机制尚未完全明确。我们通过对12项人类研究的整合分析，重建与艰难梭菌定植呈负相关的微生物网络，设计了一种合成粪菌移植（sFMT1）。这个由实验室构建的包含37种菌株的菌群在体外和动物模型中形成了一个能够抑制艰难梭菌的功能性群落。利用sFMT1作为易于操作的模型系统，我们发现胆汁酸的7α-脱羟基化并非sFMT1疗效的决定因素，而另一种进行斯蒂克兰发酵（一种竞争性营养利用途径）的菌株对于抑制艰难梭菌既是必要的也是充分的，在无菌小鼠模型中复刻了人类粪菌移植的疗效。我们的数据阐明了营养竞争在抑制艰难梭菌中的重要性，并通过稳健的方法利用公开可用的测序数据，提供了一种可用于研究复杂群落功能的通用方法。

结果Result

整合分析助力合成群落的设计

使用一个广泛的搜索词来检索通过临床诊断方法确认携带艰难梭菌的个体的人类研究，并结合微生物组测序数据。共获得268篇出版物和90个序列读取档案（SRA）数据集（图1A）。经过人工审查后，选择了90项相关研究；然而，发现其中52项缺少可追溯的已存储测序数据，而26项缺乏适当的元数据以将已存储的测序数据与参与者/艰难梭菌携带联系起来。数据收集最终包括12项研究，共计899个样本（图1B；表S1）。

图1 | 整合分析研究有助于合理设计与艰难梭菌相关的群落

(A) 通过文献综述确定了12项研究，涵盖899个样本，纳入整合分析。

(B) 研究之间的定植状态和样本分布。

(C–F) 森林图显示，(C)艰难梭菌在确诊个体中被检测到的丰度更高，这伴随着通过(D)香农多样性指数(E)费思系统发育多样性和(F)ASV丰富度测量的α多样性降低。使用Welch的t检验对个体研究的log2标准化数据进行比较，通过线性混合效应模型得出综合估计。图中显示的是变化倍数及95%置信区间。

(G) 通过各种距离度量（通过ADONIS/PERMANOVA进行统计检验）解释的艰难梭菌定植状态的变异百分比（R²）。

(H) 通过多变量分析（无权重UniFrac距离的主坐标分析，通过ADONIS/PERMANOVA进行统计分析，虚线椭圆表示95%置信区间）确定，艰难梭菌定植样本与未定植个体明显区分开来。

(I) 对于那些数据未被纳入模型训练的研究，分类器性能的接收者操作特征曲线表明，无论是否掩盖预测数据集中的艰难梭菌，微生物组组成都能准确预测艰难梭菌定植。显示了10次迭代（每次使用不同的外部研究）的平均值和标准误差。

(J) 比例分析预测特征表明，存在离散的共丰度微生物网络，它们负向预测艰难梭菌状态。所有图中N = 825个样本。

获得了原始数据，并通过统一的流程进行处理，随后因缺乏足够的深度以供进一步分析而排除了74个样本。为了验证我们的方法，我们检查了从测序数据中定量的艰难梭菌的相对丰度，发现在除了4项研究外的所有研究中，其水平都显著更高，这可能是由于艰难梭菌检测所需的严格DNA提取方法和测序深度（图1C）。微生物（α）多样性在各个数据集以及总体上都被发现有所降低（图1D–1F）。为了了解这种损失是否与保守的微生物群集有关，我们对各个研究和综合数据集进行了β多样性分析（图1G和1H）。艰难梭菌定植与微生物组组成的可重复性改变有关，在采用稳健策略（涉及5种不同距离度量）的除了一项研究外的所有研究中都发现了这一点。在各个数据集中，我们发现艰难梭菌定植解释了4.4%的变异（p

为了确定哪些微生物特征能够最稳健地预测艰难梭菌定植状态作为二元结果，我们转向了随机森林分类器。我们采用了一种迭代验证策略，每次迭代排除一项研究作为外部验证集，其余数据集分为2/3训练集和1/3测试集。虽然我们发现模型性能因数据归一化策略（包括基于系统发育信号的策略）而异，但在训练数据集中排除艰难梭菌并没有降低外部研究验证集的性能，这可能归因于随机森林的集成特性（图S1B和S1C）。我们最终排除艰难梭菌作为预测因子的模型能够在外部研究中达到0.81 ± 0.2（均值±标准差）的接收者操作特征曲线下面积，表明基于微生物组组成单独区分艰难梭菌定植个体的能力很强（图1I）。

为了更好地了解驱动预测的微生物特征，我们检查了它们通过平均降低基尼系数来衡量的重要性（图S1D）。我们发现约200个特征标志着变量重要性的拐点，几乎无法获得更多预测能力。对这些特征的丰度和分类分布进行分析发现，其中大多数是艰难梭菌定植的负向预测因子（Nnegative = 131，Npositive = 69；图S1E；表S2）。这些特征涵盖了广泛的分类范围，包括与艰难梭菌有已知相互作用的生物，如与Faecalibacterium prausnitzii、Bacteroides vulgatus、Bacteroides ovatus和Blautia obeum呈负相关，与肠球菌属和通常被描述为益生菌的乳杆菌属呈正相关（表S2）。与乳杆菌属的正相关可能解释了传统益生菌缺乏疗效的报告，但也可能受到其预期治疗用途或其对万古霉素的固有耐药性的影响，而不是与艰难梭菌的协同关系。这一点进一步证明了进行实验验证以确定这些改变的微生物组组成与艰难梭菌感染抗性之间的因果关系的必要性。值得注意的是，艰难梭菌拮抗作用的模型生物C. scindens并不是一个有效的预测因子，而携带完整bai操纵子的生物仅在20个样本中以低丰度出现（C. scindens、C. hylemonae和Peptacetobacter [Clostridium] hiranonis）。最后，我们进行了比例分析，发现不仅与艰难梭菌呈负相关的微生物，它们自身也形成了相关网络，这表明这些网络的破坏可能允许艰难梭菌入侵（图1J）。

合成群落在体外和体内形成稳定的功能群落

为了构建我们的合成群落，我们首先将预测特征（表S2）与我们基因组测序菌株收藏的全长16S rRNA序列进行比对。在可能的情况下，选择与预测特征有＞97%同源性比对的菌株，优先选择我们收藏中存在多个菌株的物种的最佳比对菌株。如果97%的匹配失败，阈值会放宽到95%，或者采用基于分类学的方法来寻找功能代表菌株。如果多个预测的16S rRNA基因变体映射到同一物种，就会包含多个代表菌株，从而导致4个物种有多个菌株覆盖（基于94%全基因组平均核苷酸同源性确定）：B. ovatus、B. uniformis、B. vulgatus和B. xylanisolvens。然后将菌株分成两个群落：sFMT1（与艰难梭菌呈负相关的菌株）和proCD（呈正相关的菌株），分别包含37和25个菌株，涵盖了广泛的分类范围（表S3）。这表明近缘操作分类单元（OTUs）之间存在功能冗余，许多特征映射到同一组菌株，最终结果是sFMT1和proCD分别有49.6%和59.4%的序列特征在属水平上有匹配。利用合成群落的加和特性，我们创建了sFMT1的一个变体，即在其中加入C. scindens（sFMT1 + Cs），以研究次级胆汁酸代谢在艰难梭菌排除中的生物学意义，以及它对群落组成和功能的影响（图2A）。

图2 | 合成群落在体外和体内形成多样而独特的群落

(A) 从纯培养菌株（表S3）构建合成菌群，并在富培养基中每日传代（n = 4个独立培养系）。

(B) 尽管在连续传代过程中，hFMT的多样性显著降低，但sFMT1的多样性保持稳定。通过16S rRNA基因测序测量多样性，使用负二项广义线性模型（GLM NB）确定传代次数的影响。

(C) sFMT1 + Cs菌株在体外的丰度随时间变化，显示出组成变化，经过4次传代后仍保持34个可分辨菌株群中的23个（CLR，中心对数2比率）。

(D) 在体外，sFMT1成员的相对丰度排名不受C. scindens（sFMT1 + Cs）加入的影响（斯皮尔曼相关性）。

(E) 使用合成群落定植无菌动物，并在14天内进行多组学分析。

(F 和 G) (F) 通过16S rRNA qPCR定量的细菌载量表明，合成群落（sFMT1、sFMT1 + Cs）和hFMT在定植后1天内实现了稳健定植，观察到的多样性在接下来的3-7天内持续增加（p

(H) 在动物定植过程中，hFMT和sFMTs的输入池中都失去了多样性（p

(I) 在实验期间，菌株的丰度继续波动，最初的埃希氏菌属的涌入被更严格的厌氧菌所取代。

(J) 体内和体外群落的组成差异显著，有些菌株只在一种条件下被检测到。虚线表示x = y（红色）±2倍丰度差异（灰色）。

(K) 通过菌株解析宏基因组测序（mFUKM，每百万映射读数的独特kmer的平均片段数；每个点代表一个动物）确定，在拟杆菌属物种内，定植效率的种内（亚种）变异是明显的。

为了了解这些菌株如何形成一个稳定的功能群落，我们开始了为期4天的分批培养实验，每天进行传代（每天约20代，图2A）。尽管在人类粪菌移植（hFMT）的连续培养中失去了相当一部分多样性，但合成群落表现出更大的稳定性，这可能归因于其各个成员的可培养性（图2B）。在最初观察到的多样性有所下降之后，单个菌株的丰度趋于稳定，大肠杆菌成为最丰富的菌株，而C. scindens的水平接近检测限度（图2C、2D和S2A）。尽管在4天后可以检测到C. scindens，但它对群落其余部分的相对组成在体外几乎没有影响，大多数菌株在sFMT1和sFMT1 + Cs之间的丰度几乎完全相同（图2D）。

鉴于富培养基并不能模拟这些微生物的自然环境，我们选择在无菌动物模型中研究合成群落的组成和功能（图2E）。利用qPCR跟踪粪便细菌水平，我们发现所有群落的稳健定植都发生在1天内，与sFMT1相比，sFMT1 + Cs和hFMT之间观察到轻微的滞后（图2F）。尽管总定植水平在1天内建立，但我们发现所有群落的可观察多样性在定植后7天内持续上升（图2G）。这一现象说明了基于测序方法的一个重要局限性，即微生物群落并未被穷尽采样。同样，无论是人类来源的群落（hFMT）还是合成群落（sFMT1和sFMT1 + Cs），都失去了相当一部分输入多样性（图2H）。跟踪扩增子序列变体的丰度表明菌株丰度随时间显著变化（图2I）。值得注意的是，早期涌入的兼性厌氧菌大肠杆菌被更具耐氧性的生物所取代，包括拟杆菌属，随后是更敏感且挑剔的生物，包括梭菌属和E. lenta（图2I和S2A）。这些观察结果支持了一个模型，即早期定植者耗尽残留的肠腔氧气，为其他微生物创造了一个允许的环境，就像在婴儿定植期间所认为的那样。进一步验证了宿主相关模型的必要性，体外和体内菌株丰度的比较表明合成群落的大多数成员的相对丰度存在显著差异，包括体内大肠杆菌水平较低，而梭菌属包括L. longoviformis、E. asparagiformis和C. spiroforme的水平较高（图2J）。

鉴于4个物种包含多个菌株，我们的基于扩增子的分析无法解析所有群落成员。为了更具体地定量菌株水平的丰度，我们利用宏基因组测序和我们之前发表的用于合成群落菌株水平跟踪的方法的一个更新版本，称为StrainR2。所有菌株都可以在输入群落中被准确定量和解析，并且菌株水平的定量与基于扩增子的数据高度一致。通过测序检测微生物的存在/缺失由于多种原因容易出现假阳性，包括条形码转换以及导致菌株特异性读段错误映射的测序错误。为了帮助解决这些问题，我们利用了一个菌株检测的统计框架（Yes/No Answers to Community membership via Hypothesis Testing；YACHT）。这些分析与我们的定量方法高度一致，但未能为所有菌株的定植提供支持，正如之前在不考虑这些测序数据特征的大型复杂群落中所报告的那样。与体外数据不同，C. scindens的加入被发现对群落中其他菌株的丰度有更明显的影响。值得注意的是，它的加入导致了A. halii、E. rectale和F. prausnitzii的额外定植，定量证据还表明B. producta和D. longicatena的定植存在差异。唯一从其缺失中受益的菌株是B. longum（log2[变化倍数]>1，校正后的Welch’s t检验的假发现率[FDR]

合成群落体内模拟复杂群落的代谢

接下来，我们试图了解sFMT如何模拟hFMT的代谢。对短链脂肪酸（SCFAs）的分析显示，与无菌（GF）对照组相比，sFMT1有广泛的产生（图3A）。有趣的是，尽管hFMT产生了更高水平的丁酸，但sFMT产生了更高水平的乙酸和丙酸。实际上，sFMT1产生的SCFAs总量显著高于hFMT。对一系列潜在微生物代谢物的比较表明，微生物定植具有广泛的影响，大多数受hFMT影响的代谢物也受sFMT1影响（图3B）。

图3 | 合成群落的体内代谢模拟hFMT

(A) 与无菌（GF）样本相比，sFMT1在体内产生显著浓度的短链脂肪酸（SCFAs），产生更多的乙酸和丙酸，但与hFMT相比丁酸水平较低。

(B) 通过核磁共振（NMR）定量代谢物，揭示了sFMT1与GF和hFMT相比的共享和独特的代谢模式。*在统计对比中p

(C) 定植导致所有群落的胆汁酸总量升高，(D)去结合胆汁酸和(E)次级（2°）胆汁酸水平升高。

(F) 每个群落导致一个离散的胆汁酸库，通过48种胆汁酸浓度的主成分分析（PCA）确定。显示95%置信椭圆。(A)–(E)的统计分析通过方差分析（ANOVA）和Tukey真实显著差异检验（HSD）进行。

同样，我们检查了微生物定植对胆汁酸库的影响，包括分析来自sFMT1 + Cs的样本，考虑到C. scindens已知具有7α-脱羟基化能力，可形成胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）。使用针对53种胆汁酸的定量方法，我们观察到所有定植组的胆汁酸总量增加，这一现象是通过涉及宿主信号因子成纤维细胞生长因子15（FGF15）的反馈机制发生的。证明了胆汁盐水解酶阳性菌株的生物活性，我们观察到定植组中胆汁酸的去结合增加，尽管与hFMT相比，合成群落的去结合水平较低。同样，我们在所有定植状态下观察到微生物胆汁酸代谢物（次级胆汁酸）的增加，sFMT1和sFMT1 + Cs中的水平显著较低，它们的次级代谢物总量没有差异。通过降维和单变量分析，我们可视化了胆汁酸库的差异，发现hFMT的组成与sFMT1和sFMT1 + Cs相距较远。值得注意的是，sFMT1和sFMT1 + Cs之间只有5种胆汁酸存在显著差异：预期的LCA和DCA产量增加，还有3,7,12-三氧胆酸及其牛磺酸结合形式，而胆酸（GCA）的水平较低。这些数据共同表明，合成群落可以复制复杂微生物生态系统的关键代谢特征，如hFMT中观察到的那样，强调了合成群落模拟原生肠道微生物群代谢复杂性的潜力，同时也揭示了可以指导其优化以用于治疗应用的差异领域。

sFMT1在没有bai的情况下对艰难梭菌感染具有保护作用

为了测试这些群落对艰难梭菌的功能，将每个群落与艰难梭菌共培养并每日传代。培养4天后，通过qPCR定量艰难梭菌的生长抑制。sFMT1和sFMT1 + Cs均能显著减少艰难梭菌的生长，而与仅含培养基的对照组相比，proCD没有显著减少（图4A）。接下来，我们使用无菌小鼠模型在体内进行功能测试，因为它们对肠道感染敏感，并且可以精确植入微生物，而不会因与内源性微生物的相互作用而产生混杂效应（图4B）。小鼠在感染前7天被定植，以便输入群落稳定（图2F–2I），然后用艰难梭菌孢子进行挑战。尽管每个微生物群落都限制了感染的严重程度（图4C），但我们发现群落之间在疾病活动程度上存在相当大的差异（图4D–4G）。值得注意的是，用hFMT定植的小鼠没有表现出感染相关的体重减轻，艰难梭菌的携带量较低，且在感染早期粪便中的毒素B水平较低（图4D–4G）。相比之下，proCD在体重减轻、艰难梭菌总携带量和毒素水平方面表现出最差的结果。proCD群落在感染后1天和4天的艰难梭菌携带量高于无菌对照组（图S4A）。sFMT1和sFMT1 + Cs与proCD相比，体重减轻、艰难梭菌携带量和毒素丰度显著减少。在感染的前2天，sFMT1和sFMT1 + Cs的保护效果存在短暂差异；然而，这些差异并未持续，也未在对比这两个群落的额外实验中复制（图4D–4G和S4B–S4F）。值得注意的是，包括hFMT在内的所有群落都没有完全抑制艰难梭菌的定植，到感染后5天，所有动物中都稳定地植入了艰难梭菌，这表明在这种模型中，保护效果是通过延迟定植和抑制毒力而不是完全排除来介导的（图S4A）。

图4 | 与艰难梭菌呈负相关的合成群落独立于胆汁酸7α-脱羟基化减轻疾病活动

(A) 来自人类粪菌移植（hFMT）的群落以及预测对艰难梭菌有抑制作用的群落（sFMT1、sFMT1 + Cs）在体外生长实验中抑制艰难梭菌，而与艰难梭菌呈正相关的菌株群落（proCD）则没有（每组n = 6个生物学重复）。

(B) 无菌感染模型的实验设计：群落稳定7天后（图2F–2I），小鼠被艰难梭菌孢子挑战，以跟踪感染和疾病活动（每组N = 8–9只小鼠）。

(C) 所有定植状态都提供了对抗感染相关死亡率的保护。

(D) 体重减轻，以感染前体重为基准进行标准化，显示出与定植状态相关的不同保护效果（*p

(E) 感染后2天（DPI）的早期体重减轻揭示了hFMT的优越功效以及proCD与sFMT1和sFMT1 + Cs之间的显著差异。

(F) 通过qPCR测定，在感染早期，hFMT、sFMT1和sFMT1 + Cs的定植导致艰难梭菌携带量减少。

(G) 在感染早期，hFMT、sFMT1和sFMT1 + Cs降低了粪便中的毒素B水平，而proCD则没有。

(H) 重复艰难梭菌感染（rCDI）模型的实验设计。小鼠接受头孢哌酮处理，随后用艰难梭菌孢子进行挑战。然后小鼠在饮水中接受万古霉素治疗，之后接受两次合成群落或自体粪菌移植（在头孢哌酮处理前收集）。

(I) 与sFMT1相比，载体对照组和mFMT导致复发的发病时间更早。

(J) 与sFMT1相比，载体对照组和mFMT导致疾病严重程度增加。图(A)和(D)–(G)的统计分析采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn事后检验并进行Bonferroni校正。图(C)和(J)的统计分析采用Kaplan-Meier检验和对数秩检验。

我们分别在抗生素诱导的艰难梭菌感染复发模型中证实了sFMT1的疗效。模拟艰难梭菌感染复发的临床背景，常规小鼠通过头孢哌酮处理被致敏以感染，随后进行感染并用万古霉素进行初步治疗（图4H）。然后，小鼠接受了两次治疗，要么是sFMT1，要么是自体小鼠粪菌移植（mFMT），并跟踪观察感染的复发情况。我们发现，与载体相比，sFMT1延迟了复发（图4I）并降低了疾病的严重程度（图4J）。有趣的是，mFMT导致比sFMT1和载体对照更严重的疾病（图4I和4J）。我们在无菌模型中复制了这一发现，表明人类来源的微生物群比我们小鼠群体中的微生物群更具保护性，即使粪菌移植来自一个人源化的小鼠（图S4G）。这进一步表明，并非所有的粪菌移植在功能上都可能等效。有趣的是，我们发现在我们常规饲养设施中的小鼠体内存在高水平的肠球菌属，其与艰难梭菌的关联（表S2）在机制上与更糟糕的感染结果相关。

进行斯蒂克兰发酵的菌株对于sFMT1的功能是必要且充分的

我们采用数据驱动的方法来识别sFMT1可能通过哪些途径来抑制艰难梭菌。按照sFMT1因其基于元分析的设计而富含对艰难梭菌有害的功能这一逻辑，我们首先检查了与hFMT和无菌（GF）定植小鼠相比，sFMT1中富集的代谢物。对我们的代谢组学数据进行检查发现，与hFMT相比，sFMT1定植小鼠中富集的代谢物数量有限，其中最显著的是5-氨基戊酸（5-AVA，图3B和S5A）。这种代谢物是脯氨酸还原斯蒂克兰发酵的产物，脯氨酸是一种典型的XI簇梭菌的代谢性氨基酸利用方式，被认为对艰难梭菌的生长和毒力很重要。我们确定了参与脯氨酸和甘氨酸斯蒂克兰发酵的酶的同源物的菌株，从而创建了一个包含29个菌株的斯蒂克兰发酵功能敲除群落（sFMT1ΔStickland1；图S5B；表S3）。通过体外实验，我们证实sFMT1ΔStickland1对脯氨酸和甘氨酸的减少没有显著影响，且不再产生5-AVA（图S5C）。为了确定去除斯蒂克兰阳性菌株（包括C. scindens）是否导致sFMT1功能丧失，我们将sFMT1 + Cs与sFMT1ΔStickland1进行了对比（图S5D）。我们发现sFMT1ΔStickland1在抑制艰难梭菌方面效果有限，仅在抑制毒素表达方面有微小影响（图S5E–S5H）。我们在实验中加入了另一个仅包含假定的斯蒂克兰发酵菌的群落，以确定它们是否足以抑制艰难梭菌感染（N = 8个菌株，sStickland1；图S5I；表S3）。在体内验证我们的预测，只有sFMT1和sStickland1定植的小鼠粪便中检测到大量5-AVA，而sFMT1ΔStickland1定植的小鼠则没有（图S5J）。观察到游离脯氨酸减少，但甘氨酸没有减少，这表明脯氨酸可能是与艰难梭菌竞争的重要底物。去除斯蒂克兰发酵菌株（sFMT1ΔStickland1）导致在生存、体重减轻、艰难梭菌总负担和毒素产生方面的保护功能丧失（图S5K–S5N）。仅包含预测的斯蒂克兰发酵菌的群落（sStickland1）提供的保护相当于或超过sFMT1，表明它们既是必要的也是充分的，作为sFMT1的功能核心（图S5K–S5N）。

接下来，我们试图了解斯蒂克兰发酵菌的保护效果是否通过竞争脯氨酸或5-AVA的生物学活性介导。为此，我们在体外近似了粪便中5-AVA的生物学相关浓度，以确定5-AVA对艰难梭菌生长、毒素产生以及孢子萌发的促进或抑制的影响，但未发现显著影响（图S5P和S5Q）。这些结果表明，艰难梭菌抑制的机制不依赖于5-AVA的生物学功能，而是依赖于对游离脯氨酸和/或其他氨基酸的竞争。

对预测的斯蒂克兰发酵菌的去除和补充产生的体内代谢物进行更深入的分析，发现其他可能有意义的代谢物存在差异，包括短链脂肪酸（SCFAs）乙酸和丁酸。这一观察结果，加上sStickland1比sFMT1提供更强保护的趋势（图S5L–S5N），促使我们进一步优化合成群落。为此，我们测量了每个sStickland1成员的脯氨酸消耗能力和相应的5-AVA产生能力。我们观察到在体外，两个菌株在脯氨酸的斯蒂克兰发酵方面表现出色（图S5R）。因此，我们重新配制了群落，生成了一个2菌株的脯氨酸发酵群落（sStickland2），以及一个相应的缺少这两个菌株的35菌株sFMT1变体（sFMT1ΔStickland2；图5A；表S3）。sStickland2在体内仍能消耗脯氨酸并产生5-AVA；然而，没有观察到SCFAs的产生（图5B和S5S）。在艰难梭菌感染后，我们发现去除这两个sStickland2菌株完全消除了sFMT1的保护能力，导致感染严重程度与无菌动物相当，表明sFMTΔStickland2甚至比proCD效果更差（图4D和5D–5F）。另一方面，sStickland2定植的小鼠没有表现出任何与感染相关的体重减轻，并且抑制了定植和毒素水平，模仿了hFMT的效果（图4D）。我们开发了qPCR检测方法，选择性地定量sStickland2成员，发现P. anaerobius菌株完全主导了sStickland2定植的小鼠，表明sStickland2实际上是一种单一高活性斯蒂克兰发酵菌株的单一定植（图5G）。检查代表sStickland2两个菌株的测序特征在人类元分析数据中的丰度发现，它们的潜在保护活性并非来自差异丰度，而是差异存在，与艰难梭菌阳性个体相比，这两种物种在艰难梭菌阴性个体中的发现频率高出一个数量级。

图 5 | 能够进行斯蒂克兰发酵的菌株对于sFMT抑制艰难梭菌是必要且充分的

(A) 实验设计（每组N = 8只小鼠）。

(B) 感染前（第0天）粪便样本的1H-NMR显示，与sStickland2相比，sFMT1ΔStickland2发酵脯氨酸生成5-AVA的能力降低，并且游离脯氨酸增加。

(C) 去除2种斯蒂克兰发酵菌株会丧失对感染相关死亡率的保护。

(D) sStickland2小鼠没有表现出与感染相关的体重减轻，而sFMT1ΔStickland2小鼠的体重减轻与无菌（GF）小鼠相当。（*p

(E 和 F) (E) 感染后1天的艰难梭菌定植和(F)毒素B的定量表明，sFMT1ΔStickland2失去了对艰难梭菌感染的保护效果，而sStickland2是足够的。

(G) 通过qPCR定量sStickland2定植中的两个菌株，发现P. anaerobius占主导地位（虚线表示检测限）。

(H) 在人类元分析中，代表sStickland2成员的操作分类单元（OTUs）的丰度表明，定植率的降低与艰难梭菌定植状态有关（两种菌株的p

sFMT的功能由对脯氨酸的竞争驱动

将sFMT1的复杂性降低到单一的P. anaerobius菌株后，我们首先证明了它单独对于sFMT1的功能是必要且充分的（图6A）。在没有P. anaerobius（sFMT1ΔPa）的情况下，通过hFMT或sFMT1定植，脯氨酸和甘氨酸主要被释放，而脯氨酸仅通过P. anaerobius的单一定植被消耗并发酵成5-AVA（图6B和S6A）。尽管脯氨酸和甘氨酸都是还原性斯蒂克兰发酵的底物，但甘氨酸的丰度并未被sStickland 1（图S5J）、sStickland2（图5B）或P. anaerobius的单一定植所改变（图6B），这表明脯氨酸是更有可能的竞争目标。我们发现，P. anaerobius以8.8e7 ± 3.8e7基因组拷贝/g粪便（均值±标准差，图S6B）的水平定植，对于通过腹泻相关体重减轻（图6C）、粪便艰难梭菌负荷（图6D）和粪便毒素B（图6E）测量的艰难梭菌保护是必要且充分的。值得注意的是，P. anaerobius单一定植所提供的保护在所有测量参数中均达到或超过了健康人类粪菌移植（hFMT）的效果（图6C–6E）。

图6 | P. anaerobius的单一定植对于sFMT通过竞争脯氨酸抑制艰难梭菌是必要且充分的

(A) 实验设计（每组N = 8只小鼠）。

(B) 感染前（第0天）粪便样本的1H-NMR显示，P. anaerobius在体内高效地将脯氨酸发酵成5-AVA。

(C) P. anaerobius单一定植的小鼠没有表现出与感染相关的体重减轻，与hFMT相当，而sFMT1ΔPa小鼠的体重减轻与无菌（GF）小鼠相当。（*p

(D 和 E) (D) 粪便艰难梭菌和(E)毒素B的定量表明，P. anaerobius对感染具有保护作用，而在sFMT1ΔPa定植的小鼠中这种保护作用丧失。

(F) 与sFMT1ΔPa相比，P. anaerobius导致感染后7天促炎细胞因子表达降低。

(G) 在P. anaerobius的上清液中，通过补充脯氨酸部分挽救了艰难梭菌的生长，但通过额外的氨基酸或蛋白胨并没有进一步增强。缩写：Cd，艰难梭菌；Min，ATCC微量矿物质补充剂；Vit，ATCC维生素混合物；Glu，葡萄糖。AA mix含有苯丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸。

(H) 与载体和载体对照组相比，表达PutA的大肠杆菌在体外显著抑制了艰难梭菌的生长，无论是在哪种生长培养基中测试（每组n = 6）。图(B)–(F)和(H)的统计分析采用Kruskal-Wallis检验、Dunn事后检验和Bonferroni校正；图(G)采用Kruskal-Wallis检验、Dunn事后检验和Benjamini-Hochberg校正。

我们还试图检查P. anaerobius可能的其他保护机制：非7α-脱羟基化胆汁酸代谢、宿主免疫调节以及抗菌肽的产生。我们没有在用sStickland2定植的小鼠中发现微生物胆汁酸代谢的证据，排除了这种可能的机制。为了检查P. anaerobius是否引发免疫反应，改变动物的炎症状态，我们利用Luminex小组分析结肠中的细胞因子。与无菌（GF）小鼠相比，P. anaerobius导致白细胞介素（IL）-1β和IL-6的丰度轻微下降，表明具有抗炎表型；然而，包括IL-33和IL-17A在内的其他标记物浓度没有改变，而这些标记物已被指在对艰难梭菌的反应中很重要。感染后7天的炎症标记物检查显示，主要炎症标记物IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）显著下降，与感染活动减少一致。这些结果表明，尽管P. anaerobius并非免疫惰性，但它单独并不刺激可能增强对艰难梭菌反应的途径。我们进一步调查了这种抑制是否依赖于P. anaerobius产生的任何代谢物或细菌素。通过延迟和同时抑制实验，我们没有发现P. anaerobius直接抑制艰难梭菌的证据，这进一步强化了营养竞争是主要的抑制机制。

我们分析了P. anaerobius的培养上清液，发现脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和蛋氨酸的利用显著增加。艰难梭菌在P. anaerobius上清液中显示出显著的生长障碍，但通过添加新鲜培养基可以挽救这种生长障碍，这进一步提供了抑制并非由抑制性代谢物的形成导致的证据。通过添加葡萄糖、微量矿物质或维生素无法挽救生长；然而，添加脯氨酸、之前提到的耗尽的氨基酸以及富含肽的蛋白胨，都可以部分恢复生长，与单独添加脯氨酸相比没有显著差异。我们试图更普遍地证明对脯氨酸的竞争导致了艰难梭菌的抑制。为此，我们在大肠杆菌中过表达大肠杆菌脯氨酸利用基因putA，导致脯氨酸利用显著增加。与载体对照相比，putA的表达导致体外艰难梭菌的丰度降低了1到2个数量级。这些结果共同突出了对脯氨酸的竞争是微生物抑制艰难梭菌的关键机制。

作者简介

宾夕法尼亚州立大学生物化学与分子生物学系Shuchang Tian为本文第一作者，宾夕法尼亚州立大学和同一健康微生物组中心的生物化学和分子生物学助理教授Jordan E. Bisanz为本文的通讯作者。

Jordan E. Bisanz(通讯作者)

Jordan Bisanz 是宾夕法尼亚州立大学和同一健康微生物组中心的生物化学和分子生物学助理教授。Bisanz 实验室将计算分析和湿实验室实验相结合，以了解肠道微生物如何相互之间以及与宿主相互作用。该实验室专门将人类干预研究与多组学方法和无菌动物模型相结合，以了解宿主-微生物相互作用如何塑造健康，从而产生机制见解和转化靶标。相关学术成果发表于Cell Host & Microbe、Nature和Nature Reviews Microbiology等杂志上。信息来源：https://bisanzlab.com/members/jordan-bisanz.html

翻译：杨海飞，青岛农大，基因组所联培硕士在读;

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后;

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导;

排版：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读

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来源：微生物组