摘要：在抗体偶联药物（Antibody - drug conjugates，ADC）的复杂体系中，抗体内化是 ADC 药物发挥作用的关键环节。抗体作为 ADC 药物的重要组成部分，其内化能力直接影响药物疗效与安全性。

在抗体偶联药物（Antibody - drug conjugates，ADC）的复杂体系中，抗体内化是 ADC 药物发挥作用的关键环节。抗体作为 ADC 药物的重要组成部分，其内化能力直接影响药物疗效与安全性。

一、抗体内化的分子机制与途径探索

1.抗体内化的本质与细胞旅程

抗体内化，即抗体内吞，指细胞表面抗体与对应抗原结合后，借助细胞自身运输体系，将抗体 - 抗原复合物转运至细胞内部并发挥特定生物学功能的过程。大多数 ADC 药物分子以此方式进入细胞发挥对肿瘤细胞的毒性效应。常规内吞作用一般分为芽形成、膜弯曲与囊泡成熟、膜分裂并释放至细胞质三个阶段，为抗体内化提供了基本细胞生理基础。

2.ADC 药物内化途径的精细分类

对已上市 ADC 药物内化方式的研究表明，其内化途径依据是否依赖网格蛋白，可分为网格蛋白介导的内吞作用（CME）与网格蛋白非依赖性内吞作用两类。其中，网格蛋白非依赖性内吞作用又进一步细分为小窝蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白非依赖性载体蛋白 / GPI 锚定蛋白富集的早期内体区室（CLIC/GEEC）和巨胞饮作用。

网格蛋白介导的内吞作用是 ADC 药物内吞的重要途径，其过程包含一系列紧密相连且部分重叠的步骤。不同受体触发 CME 的机制存在差异，既可以由质膜上某些受体组成型启动，也能通过受体与配体和 / 或抗体结合来开启。当细胞质中的内吞衣壳蛋白开始在质膜内小叶聚集时，CME 起始。衣壳蛋白通过募集细胞质中的额外接头蛋白并与之相互作用，持续组装与生长。关键衔接蛋白促使膜弯曲，将内化受体 / 配体聚集到 “网格蛋白包被坑”（CCP）中。随着 CCP 内陷加深，其颈部收缩，通过断裂过程与质膜分离。肌动蛋白聚合助力 CCP “向内” 进入细胞质，直至分裂完成，CCP 转变为网格蛋白包被的囊泡（CCV）。最终，CCV 外壳解体，CCV 与内体融合并分选至特定亚细胞位置，或者循环回到细胞表面。这一过程的各步骤精确有序，确保了抗体内化的高效进行。

二、影响抗体内化的多元因素剖析

1.靶点

抗体能否被内化，靶点起决定性作用。不同靶点具有特定结构，只有与之匹配的抗体才能启动内化进程。而抗体内化效率受多方面因素综合影响。

2.抗体自身特性的影响

抗体的亲和力与特异性对其内化有重要影响。亲和力高的抗体与抗原结合能力强，为内化提供动力；特异性高的抗体能精准识别抗原，避免非特异性结合，确保内化的准确性与高效性。

不同类型和亚型的抗体，通过不同的受体和信号通路影响内化速度与效率。例如，IgG 和 IgA 内化速度相对较快，而 IgM 和 IgE 内化速度较慢，这反映了不同抗体在细胞内运输机制上的差异。

抗体的剂量和浓度对其内化呈 “双刃剑” 效应。剂量和浓度增加，抗体与抗原结合机会增多，内化可能性增大；但过高剂量和浓度可能导致受体饱和或下调，降低内化效果。

3.细胞因素的影响

不同类型细胞的受体表达和内化能力不同。B 细胞和巨噬细胞内化能力较强，T 细胞和红细胞内化能力较弱，这种天然差异显著影响抗体内化效果。

细胞状态是影响内化动力学的重要因素。活化细胞内化速度较快，凋亡细胞内化速度显著减慢。此外，分子量较大的抗原通常更难被细胞内化；针对同一靶点的不同抗体，因结构等因素也会展现出不同的内化效率。因此，在 ADC 药物研发中，筛选高内化效率的抗体对确保药物安全性与有效性至关重要。

三、抗体内化检测技术的全景透视

1.基于活细胞成像的内化检测

基于活细胞成像的内化检测（Incucyte），通过实时活细胞成像仪对裸抗进行药效动力学实时监测。与传统终点检测不同，它采用多浓度点、多时间点检测模式，可对活细胞进行长达 72 小时的连续观察。这种动态监测方式为深入了解抗体内化过程提供了丰富时间序列数据，是研究抗体内化的有力工具。

2.基于毒素偶联的杀伤检测

基于毒素偶联的杀伤检测主要包括 DT3C 法与 Mab - ZAP 方法。这两种方法均利用抗体 - 毒素复合物在细胞内释放毒素引发细胞毒性的原理，通过检测细胞杀伤情况评估抗体的内化效果。DT3C 是 2014 年 MikiYamaguchi 等人利用基因重组技术生产的重组蛋白，由无受体结合域的白喉毒素（DT）和链球菌蛋白 G 的 C1、C2、C3（3C）结构域构成；Mab - ZAP 由小鼠抗体和核糖体失活蛋白皂草素组成。相较于传统的 Mab - ZAP 方法，DT3C 法中的 mAb - DT3C 偶联物具有分子量更稳定、内化效率更高、适用性更广、成本更低等优势，为抗体内化检测提供了更优化选择。

3.基于 pH 探针与温度转变的内化检测

基于 pH 探针的内化检测与基于温度转变的荧光二抗内化检测是细胞内化过程检测的常用方法。基于 pH 探针的内化检测利用荧光探针对 pH 值的敏感性，通过反映细胞内囊泡的酸化程度判断内化进程与位置；基于温度转变的荧光二抗内化检测利用荧光二抗在不同温度下荧光强度的变化，区分细胞内外的荧光信号，进而判断内化效率与程度。

不过，这两种方法各有优缺点。基于 pH 探针的内化检测操作简便，荧光信号清晰且可定量分析，适用于高通量筛选，但需精准选择合适的 pH 敏感探针，并应对其可能受到的多种干扰因素；基于温度转变的荧光二抗内化检测则需精确控制温度变化，同时要考虑不同荧光二抗的温度敏感性差异以及温度转变对细胞生理状态和内化动力学的潜在影响。

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文章来源：抗体内化：ADC 药物研发的核心奥秘解析

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来源：斯达特生物