摘要：肝移植是目前治疗终末期肝衰竭的唯一有效手段。然而，由于临床需求旺盛，供体严重短缺。近年来，人肝类器官在肝病再生医学领域展现出巨大的潜力。然而，目前在孔板中培养类器官严重依赖基质胶（Matrigel），限制了类器官培养的可扩展性和产量。

肝移植是目前治疗终末期肝衰竭的唯一有效手段。然而，由于临床需求旺盛，供体严重短缺。近年来，人肝类器官在肝病再生医学领域展现出巨大的潜力。然而，目前在孔板中培养类器官严重依赖基质胶（Matrigel），限制了类器官培养的可扩展性和产量。

2025年3月，来自华东理工大学、浙江树人学院和浙江大学的团队在中科院1区5.9分Top期刊Cell Proliferation上发表了题为《Scalable Matrigel-Free Suspension Culture for Generating High-Quality Human Liver Ductal Organoids》的文章。

研究人员提出了一种突破性的培养模式，该模式完全消除了对细胞外基质水凝胶的依赖，基于机械搅拌生物反应器中的细胞悬浮培养模式成功制备功能性人肝脏导管类器官。

让我们一起解读这篇文章中介绍的肝类器官培养技术，看看这一模型在肝衰竭治疗研究领域的应用前景！

文章介绍

#1

研究背景

Background

与同种异体移植或iPSC衍生的类器官相比，成体干细胞衍生的类器官作为再生医学的细胞来源具有免疫排斥方面的优势。然而许多因素限制了类器官的规模化制备。

类器官培养途径通常在静态条件下进行，基质凝胶载体促进细胞分化和自组装。最常用的基质胶源自小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白质混合物，为细胞提供结构支撑和细胞外信号传导。然而，动物源性基质胶可能含有残留的动物蛋白成分，并且由于动物个体差异和生理状态的不同，基质粘附性可能存在差异。其次，与悬浮培养系统相比，静态扩增过程需要更大的单位生长表面积和更多的人工操作，这将影响实验的可重复性和结果的可靠性。

肝类器官拥有复杂的生长微环境，其通过机械感应驱动细胞机械转导，导致组织结构改变。作者推测传统的静态培养无法提供促进细胞生长所需的机械力，限制细胞生长的速度和质量。因此，有必要开发一种新的培养策略，既能满足再生医学的需求，又能突破目前的培养限制，消除对基质胶的需求，并提供促进细胞生长所需的机械力。

#2

研究思路

Methods

本文研究提出了一种高效的无Matrigel悬浮培养方法，用于大规模生成自我更新的三维肝脏导管类器官。通过优化培养条件，研究团队成功地在悬浮培养体系中获得了高质量的肝脏导管类器官，并验证了其细胞活力、细胞谱系以及肝脏导管标志物的表达。

进一步扩展了肝脏导管类器官的培养规模，在50 mL的摇瓶生物反应器中进行大规模培养。此外，研究还探讨了悬浮培养的肝脏导管类器官的移植潜力，发现其能够有效改善小鼠的肝脏损伤和炎症，展示了这一新型培养方法在肝脏疾病修复中的应用前景。

该研究为类器官培养提供了新的思路，尤其是在无Matrigel的大规模培养方面，具有重要的实际意义和应用价值。

#3

研究结果

Results

1. 静态培养与悬浮培养中肝脏类器官生长的比较

为了评估悬浮培养类器官的生长优势，比较了肝脏类器官在含基质胶的二维静态培养和在没有基质胶的生物反应器中进行的三维悬浮培养下的大小和细胞数量。

如图2A所示，在悬浮培养中，肝脏导管类器官发展出了类似静态培养中观察到的含腔囊性结构。然而，悬浮培养中类器官的生长速率通常优于静态培养。在第5天时，悬浮培养中类器官的直径达到了800 μm，在第14天时达到了2000 μm。悬浮培养中类器官的大小是静态培养中类器官的三倍。因此，所开发的悬浮培养方法适用于肝脏导管类器官的生长，并在促进类器官形成方面具有优势。

此外，两组的测量结果表明，悬浮培养中类器官在14天内的平均大小是静态培养的2.6倍（图2B）。在相同的初始细胞数和培养时间条件下，悬浮培养中获得的类器官细胞数在第7天和第14天时均大于静态培养（图2C）。这种现象可能与机械力的传递有关，特别是剪切应力通过细胞膜和细胞骨架等结构进入细胞内部，调节细胞内的信号通路，促进细胞增殖和存活。

图2

2. 悬浮培养的肝脏导管类器官表现出胆管细胞的特征

肝脏导管类器官通常可以分化为胆管细胞和肝细胞。因此，作者研究了肝脏导管类器官在悬浮培养条件下的分化特征。

首先通过评估增殖和凋亡生物标志物的免疫荧光来表征类器官的细胞活力。如图3A所示，肝脏导管类器官表现出优异的细胞活力，PCNA染色结果呈阳性。然而，作为细胞凋亡标志物的Cleaved-caspase-3未在细胞中检测到，表明培养的类器官未经历凋亡。

在该悬浮培养系统中，类器官以簇状形式生长。作者比较了悬浮培养的肝脏导管类器官、簇状培养的原代肝细胞和在相同培养条件下作为单细胞培养14天的原代肝细胞中胆管、肝细胞和干细胞的特征标志物表达水平（图3B-D）。悬浮培养的肝脏导管类器官中，胆管细胞特异性标志物KRT19、KRT7和SOX9的表达显著高于原代肝细胞。肝细胞生物标志物如ALB和CYP3A4在类器官中的表达较原代肝细胞低。

这些结果表明，悬浮培养的肝脏导管类器官保持了优异的增殖潜力和双能干性，表现出更多胆管细胞的特征。为了验证这些结果，通过在相同条件下培养原代肝脏组织细胞（作为单细胞培养）来对比。结果表明，作为单细胞在悬浮培养中培养的肝细胞失去了干性和肝细胞特征。

图3

3. 悬浮培养增强高质量人类肝脏导管类器官的生成

在确认悬浮培养的类器官具有胆管细胞特征后，作者比较了悬浮培养与静态培养条件下类器官的分化水平。通过qPCR和免疫荧光分析，检测了肝脏导管类器官中胆管细胞和肝细胞特异性标志物的表达。

qPCR结果显示，悬浮培养的类器官表现出增强的谱系标志物水平和较高的干性（图4A-C）。免疫荧光实验显示，肝脏导管类器官展示了表达胆管细胞谱系标志物（如KRT19、KRT7和EPCAM）的囊性结构，而肝细胞谱系标志物HNF-4a的表达较低（图4D）。

与静态培养的类器官相比，悬浮培养的类器官显示出更明显的胆管细胞谱系标志物和肝细胞谱系标志物的表达。为了进一步检测与肝脏导管相关的生物标志物，作者进行了Western blot实验。采用与悬浮培养条件相同的分离原代细胞作为对照。如图4E-H所示，悬浮培养的类器官的肝脏和肝脏导管谱系标志物较传统基质胶培养的类器官表现出更强的表达。悬浮培养中的肝脏和肝脏导管标志物的表达几乎是静态培养模式下的两倍。

然而，单独的细胞在体外培养后失去了肝脏和肝脏导管结构的特征。这表明，类器官能够在体外培养中保持肝脏导管的特征，且悬浮培养的类器官更有利于保持这些特征。这些结果表明，在悬浮培养条件下，从具有双能干性的原代肝细胞生长的肝脏导管类器官，比静态培养条件下的类器官展示出更高质量的肝脏导管特征。

图4

4. 成熟胆管细胞功能验证

正常肝脏导管上皮细胞中会表达多药耐药相关蛋白1（MDR1）基因，参与各种药物的外排。因此，作者使用罗丹明123染料来检测肝脏导管类器官的药物外排能力。

在将肝脏导管类器官与罗丹明123染料共孵育后，观察到绿色荧光积聚在类器官的囊腔内，表明MDR1在药物运输中发挥了作用（图5A）。在MDR1抑制剂维拉帕米存在的情况下，绿色荧光显著减少，且未观察到荧光聚集（图5B）。荧光强度的变化进一步证实了肝脏导管类器官通过MDR1主动运输药物。

免疫荧光分析用于胆管细胞标志物定位，并评估肝脏导管类器官的上皮极性。如图5C所示，类器官显示出ZO1和β-连环蛋白的局部表达，表明它们已获得了极性。

在肝脏中，胆管细胞的一个关键生理功能是胆汁调节。为了评估体外成熟胆管细胞的功能，作者测试了法尼醇X受体（FXR）的激活（图5D）。FXR是一种由胆汁酸激活的转录因子，主要分布在肝脏、回肠和肾脏中。它在维持胆汁酸平衡中起着至关重要的作用，是最重要的核受体之一，促进胆汁流动以防止胆汁淤积。胆管细胞中特定的有机溶质转运蛋白负责胆汁酸的排泄（由SCL51A和SLC51B基因编码）。

在FXR激活剂GW4064处理后，观察到SLC51A/B的表达水平上升，与核受体的激活一致。这些结果表明，悬浮培养条件下的成熟胆管类器官可以进行FXR介导的胆汁酸稳态调节，这对建模胆汁淤积具有重要意义。总之，这表明悬浮培养模式下培养的肝脏导管类器官具有良好的肝脏导管功能，并可用于进一步的研究。

图5

5. 解离类器官的细胞活力

在细胞移植过程中，类器官必须被消化成单个细胞才能进行移植准备。作者分析了通过酶水解解离的类器官的单细胞质量和活力。首先使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒评估了解离后单细胞的凋亡（图6A-B）。

典型的Annexin V-FITC/PI凋亡检测表明，解离过程几乎没有诱导细胞的显著凋亡。根据类器官中荧光橙（绿色）的强度，结果表明，在连续传代后，悬浮条件下培养的肝脏导管类器官保持了相当的活力（图6C）。从培养类器官中获得的单细胞的高活力表明，它们适用于细胞移植。

图6

6. 在烧瓶生物反应器中扩增类器官培养

在培养板中的基础培养方法可能不适合移植数十亿细胞的需求，因此需要优化实验方案来满足日益增长的需求。类器官作为三维聚集体，在50 mL旋转烧瓶容器中进行了动态悬浮培养。

图7A显示了典型的球形腔结构，证明了旋转烧瓶悬浮培养系统的可行性。此外，在旋转烧瓶中培养的肝脏导管类器官表现出了明显的肝脏导管特征，类似于静态培养条件下的表现（图7B-C）。

通过免疫荧光分析和qPCR实验结果显示，肝脏导管类器官表现出较高的胆管细胞谱系标志物（KRT19）的表达，且与培养板中的类器官相当。这些结果表明，悬浮培养系统可以进一步扩展培养体积，以满足肝脏导管类器官的大规模需求。

图7

7. 力敏感通路增强肝脏导管类器官的分化

为了更深入地了解改变培养环境对肝脏导管类器官转录组产生的影响，作者对来自三个不同供体的肝脏导管类器官进行了RNA测序，这些类器官分别在含有Matrigel的静态（2D）条件下和不含Matrigel的悬浮（3D）条件下进行培养，共鉴定出2059个差异表达基因（DEG）（图8A）和胆道特异性基因的表达模式（图8B）。

作者进一步对差异表达基因进行了KEGG通路分析（图8C）。结果显示，悬浮培养中上调的基因富集于胆汁分泌、ECM-受体相互作用等通路，这表明悬浮培养环境中的机械力可能通过特定的信号通路影响基因表达，从而调控细胞的分化命运。

进一步分析与细胞-基质黏附相关的基因，发现这些基因在悬浮培养中大多被上调，进一步说明在缺乏ECM的情况下，外部物理信号也可能促进细胞生长（图8D）。GO分析也证实，悬浮培养类器官中上调的基因在细胞-基质黏附和力敏感转导相关的GO条目中显著富集（图8E）。

图8

使用Cytoscape中的MCODE插件分析上调的差异表达基因，结果揭示了最紧密关联的基因模块，其中包括20个显著差异表达基因和97对相互作用关系（图9A）。这些基因多与ECM相关组分相关，如胶原蛋白COL3A1、COL1A2、COL16A1以及生长因子HGF和FGF20。

蛋白共表达分析显示，这些基因参与细胞外基质重塑、上皮细胞迁移及PI3K信号通路等生物过程（图9B）。已有研究报道，PI3K信号通路受到机械力的调控，是调节细胞分裂、生存与分化最关键的通路之一。根据GSEA结果，悬浮培养显著上调了与细胞黏附分子、ECM-受体相互作用和PI3K信号通路相关的基因表达（图9C）。

综上结果可以推断，悬浮培养中的机械力能够调节细胞外基质-受体相互作用通路，并通过转导外部物理信号，激活PI3K信号通路，从而增强肝脏导管类器官的分化能力和增殖能力。

图9

8. 力敏感通路增强肝脏导管类器官的分化

为了探讨这些类器官模拟胆道纤维化的能力，作者检测了TGFβ信号激活后基质积累和器官功能障碍的影响（图10）。在悬浮培养条件下，类器官在有无TGFβ（25 ng/mL）处理的情况下培养48小时，之后评估纤维化相关基因的表达。

结果表明，在TGFβ信号通路激活后，肝脏导管类器官中平滑肌α-2肌动蛋白（ACTA2）、Ⅰ型胶原蛋白α1链（COL1A1）和金属蛋白酶抑制因子1（TIMP1）的表达水平上调。这表明，悬浮培养的肝脏导管类器官能够有效模拟胆道促纤维化反应，为高效构建胆道促纤维化模型提供了一种潜在的方法。

图10

9. 悬浮培养的肝脏导管细胞移植改善肝脏损伤和炎症

为了验证新型悬浮培养的肝脏导管类器官是否具有修复肝脏损伤的潜力，作者进行了肝脏导管类器官的移植实验（图11A）。与健康小鼠相比，移植对主要器官没有影响，表明肝脏导管细胞移植在体内是安全的（图11C）。

通过肝脏损伤后肝脏导管细胞移植处理，发现移植缓解了小鼠的体重减轻（图11B）。与肝脏损伤小鼠相比，移植后小鼠的血清肝功能指标（ALT、ALP、BLIT）显著下降，表明细胞移植改善了肝脏损伤（图11D）。

重要的是，移植后进行原位细胞移植后，使用流式细胞术检测KRT19+人类肝脏导管细胞在其他器官（心脏、脾脏、肺、肾）中的比例。结果显示，移植后没有人类肝脏导管细胞在其他器官中定植，证明了原位细胞移植的安全性（图11E）。

图11

肝脏切片的组织病理学检查显示，与肝脏损伤小鼠相比，接受细胞移植处理的小鼠胆汁淤积、胆管细胞增生伴炎性浸润、肝细胞坏死轻微（图12A）。肝脏组织的Western blot结果也显示，细胞移植后胆管细胞标志物KRT19的表达有上升趋势（图12B）。

此外，作者还检查了肝脏组织中胆汁酸转运基因（MDR1、MDR2、MRP2、NTCP、BESP）的相对表达，结果显示细胞移植后胆汁酸转运基因的表达增加，可能是由于胆管细胞损伤的修复和胆汁淤积的缓解（图12C）。细胞移植还缓解了胆道损伤（图12D）。

治疗后胆道纤维化明显减少，胆管的特征恢复，表明肝胆类器官具有良好的移植效果。同时，检测了移植组促炎基因（IL-8、IL-6、TNFα、IL-1β）和抗炎基因（IL-4、Arg1、IL-10、TGFβ）的相对表达，发现肝脏导管细胞移植降低了促炎基因的表达，同时增强了抗炎基因的表达（图12E、F）。

小结

在本研究中，作者开发了一种高效且不含Matrigel的悬浮培养方法，生成自我更新的三维肝脏导管类器官。该方式可用于大量且高质量的类器官培养。

作者评估了生成的肝脏导管类器官的细胞活力、细胞谱系，并进行了Western blot验证，确认了肝脏导管的生物标志物。肝脏导管类器官的培养进一步扩展到50 mL的摇瓶生物反应器中。作者进行了悬浮培养的肝脏导管类器官移植到小鼠体内的实验，结果表明该移植可以改善肝脏损伤和炎症。

因此，本研究为类器官培养提供了新的视角，突出了肝脏导管类器官的功能性和干性特征，特别是在无Matrigel的大规模培养中的应用。

参考文献

Gong S, He K, Liu Y, et al. Scalable Matrigel-Free Suspension Culture for Generating High-Quality Human Liver Ductal Organoids. Cell Prolif. Published online April 1, 2025. doi:10.1111/cpr.70033

来源：培养盒守护者