摘要：​​动脉粥样硬化（AS）是心脑血管病的主要发病原因。AS 是内膜病变开始，先后出现脂质、复合糖类聚集、纤维组织增生、钙质沉着形成斑块等，继发性病变出现斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成［1］。AS 易导致缺血性脑卒中、心肌梗死、缺血性心脏病、心脏性猝死等心血管

​​动脉粥样硬化（AS）是心脑血管病的主要发病原因。AS 是内膜病变开始，先后出现脂质、复合糖类聚集、纤维组织增生、钙质沉着形成斑块等，继发性病变出现斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成［1］。AS 易导致缺血性脑卒中、心肌梗死、缺血性心脏病、心脏性猝死等心血管疾病，产生高致残或致死的严重后果［2-3］。中国心血管病患病率以及死亡率仍处于上升阶段，心血管病死亡率高于肿瘤及其他疾病居于首位，占居民疾病死亡构成的 40% 以上，《中国心血管病报告 2018》概要中推算出心血管病现患人数 2.9 亿［4］。

中医药凭借其特有的优势，在 AS 的防治中一直发挥着重要作用，尤其是活血化瘀类中药，在临床中应用也较为广泛，并且取得了一定疗效［5-7］。龙生蛭胶囊是在补阳还五汤基础上加减，由黄芪、水蛭、川芎、当归等 12 味中药制备而成的胶囊剂。功效补气活血，逐瘀通络，常用来治疗脑梗塞恢复期，还能延缓中风高危人群动脉硬化的进展［8-9］。龙生蛭胶囊虽然在临床报道有一定的抗 AS 的效果［10-11］，但是针对龙生蛭胶囊对 AS 药理学方面的研究很少，作用机制也不不明确，因此本文拟选用高脂饮食诱导的载脂蛋白 E 敲除（ApoE-/-）小鼠 AS 模型，并采用龙生蛭胶囊干预给药，以考察龙生蛭胶囊对 AS小鼠的作用效果，并探讨可能的作用机制，为龙生蛭胶囊的临床应用提供数据支持。

1 材料

1.1 动 物 60 只 雄 性 5 周 龄 ApoE-/-小 鼠 ，体 质 量16~18 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号 SCXK（京）2016-0006。实验部分均符合北京中医药大学动物伦理委员会标准（伦理委员会批准号 BUCM-4-2018090601-3039）。

1.2 药物 龙生蛭胶囊（陕西步长制药有限公司，批号 20171250）；辛伐他汀片（广东彼迪药业有限公司，批号 20171002）。

1.3 试剂 柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液、磷酸盐缓冲液（PBS）、苏木素-伊红（HE）染液、一抗（CD34）、一抗（F4/80）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗、组化试剂盒 DAB 显色剂、油红染液、BSA、多聚甲醛（美国 Servicebio 公司，批号分别为 G1202、G0002、 G1004、 GB13013、 GB11027、 GB23303、G1211、G1016、G5001、G1101）；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为 20180412、20180418、20180526、20180906、20180412、20180418）；白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6 检测试剂盒（拜尔迪生物科技公司，批号分别为 L191105284、1331548705）。

1.4 仪 器 Neofuge 15R 型 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机（美国 Heal Force 公司）；DW-86L626 型超低温冰箱（海尔集团）；Chemray 240 型全自动生化分析仪（深圳 雷 杜 生 命 科 技 ）；S40-SLIDER 型 荧 光 显 微 镜 、RM2016 型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5 型包埋机、JB-L5 型冻台（武汉俊杰电子有限公司）；Nikon Eclipse CI 型正置光学显微镜、DS-U3型成像系统（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 小鼠适应性喂养 1 周后随机分组，分为正常组（12 只）和 AS 模型组。正常组喂养普通饲料，AS 模型组参考文献［12-14］方法喂食高脂饲料［83.75 维持饲料+15% 猪油+1.25% 胆固醇，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司］，连续喂养8 周。制备 AS 模型后，随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组和龙生蛭胶囊低、中、高剂量组（中药低、

中、高剂量组），每组 12 只小鼠。辛伐他丁组灌胃剂量为 4 mg·kg-1，龙生蛭胶囊高、中、低剂量组灌胃剂量分别为 1.6、0.8、0.4 g·kg-1，正常组和模型，分别灌胃生理盐水，灌胃体积均为 100 mL·kg-1。连续灌胃10 周（灌胃剂量均由临床给药剂量换算得到，中剂

量来自于临床等效剂量的换算，低、高剂量分别为中剂量的 0.5、2 倍）。

2.2 血 脂 检 测 实 验 结 束 后 ，小 鼠 摘 眼 球 取 血 ，4 000 r·min-1 离 心 10 min（ 离 心 半 径 为 7.5 cm，下同），取上清液，用全自动生化分析仪检测 TC、TG、HDL-C 及 LDL-C 水平。2.3 血 清 生 化 学 检 测 实 验 结 束 ，摘 眼 球 取 血 ，4 000 r·min-1离心 20 min，取上清液，按照试剂盒方法，检测小鼠血清 SOD、MDA、IL-1β 和 IL-6 的水平。2.4 病理样本制备 实验结束，处死小鼠，取出主动脉，置于 4 ℃ PBS 中清洗 3 次，一部分小鼠主动脉置于 4% 多聚甲醛中固定制备石蜡切片，一部分用OCT 包埋剂包埋制备冰冻切片，剩下的小鼠主动脉置于-80 ℃的冰箱中冻存备用。

2.5 病理观察 用制备的石蜡切片进行 HE 染色，OCT 冰冻切片进行油红 O 染色，显微镜镜检，进行拍照，观察小鼠主动脉血管斑块斑块及脂肪堆积。

2.6 免疫组化染色检测 CD34、F4/80 表达 将切片进行抗原修复后，3%BSA 后进行室温封闭 30 min，加 入 PBS 稀 释（1∶1 000）的 一 抗 CD34、F4/80 进 行4 °C 湿盒孵育过夜，PBS 清洗后，加入二抗室温孵育50 min，DAB 显色，显微镜镜检，拍照。

2.7 统计学分析 采用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析，所有数据均以 xˉ±s 表示，组间比较用 t 检验，P

3 结果

3.1 对 ApoE-/-小鼠血脂水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清中 TG、TC、HDL-C 和 LDL-C 水平均显著升高（P

3.2 对 ApoE-/-小鼠 SOD、MDA、IL-1β 和 IL-6 的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清中 MDA、IL-1β和 IL-1 显 著 升 高（P

3.3 对 ApoE-/-小鼠主动脉组织结构形态学的影响

小鼠主动脉 HE 染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠主动脉有明显斑块形成病变范围及程度明显较高。其他各组小鼠主动脉官腔中斑块面积不同程度减小，辛伐他丁和中药各剂量组粥样斑块面积明显减小。见图 1。

3.4 对 ApoE-/-小鼠主动脉斑块形成的影响 正常组主动脉各层组织正常，内皮完整，未见明显病变。模型组主动脉内皮下脂质沉积，可见斑块形成，部分严重坏死，同时主动脉的血管壁增厚明显，管壁面上沉积较多红色脂质，导致管腔狭窄。辛伐他汀及中药高、中、低剂量均能降低主动脉脂质沉积及抑制 AS 斑块的形成，其中辛伐他汀及中药高剂量组抑制斑块形成效果尤为明显。见图 2。

3.5 对 ApoE-/-小 鼠 血 管 CD34、F4/80 表 达 的 影 响正常组小鼠主动脉内皮结构清晰，无挤压变形，图中细胞核被染为蓝色，阳性表达为棕黄色，内皮下较少染成棕黄色的 CD34、F4/80 存在。与正常组比较，模型组小鼠主动脉内膜可见 CD34、F4/80 的阳性表达明显升高（P

中药高、中、低剂量组小鼠 CD34、F4/80表达集中于内皮下斑块中，与模型组比较，辛伐他汀组和中药高、中、低剂量组小鼠 CD34 阳性表达明显减少（P

结果差异无统计学意义。见图 3和图 4，表 3。

4 讨论

AS 的重要发病机制为血脂代谢异常，典型病变为动脉血管内膜的脂质沉积、炎症细胞浸润，以及内膜灶状纤维化导致动脉脂质沉积、斑块形成、内膜增厚、管腔狭窄［15-16］。ApoE-/-小鼠是当前用于 AS研究的经典动物模型，高脂膳食饲养小鼠造成其体内脂质大量累积，由于缺乏 ApoE 基因，小鼠血液循环中脂质代谢受阻，更容易引发 AS 疾病，其组织学形态及病理上与人类疾病极为相近［17-18］。AS 相关脂质标志物为 TC、LDL、LDL-C、LDL 颗粒数（LDLP）、载脂蛋白 B、HDL 等［19-20］。有研究还表明，LDL浓度升高，能够上调高 HDL 浓度，增加单核细胞数目，加重血管炎症［21］。在本次实验中，龙生蛭胶囊能 够 明 显 降 低 AS 小 鼠 模 型 血 清 中 TG、LDL-C 水平，降低 IL-1β 和 IL-1 水平。有研究表明，AS 发生的过程中，脂质过氧化同样发生，AS 发生时，MDA产生增多，SOD 活性下降［22-23］

，本实验中龙生蛭胶囊能够显著降低 AS 小鼠模型血清中 MDA 水平，提高SOD 水平。说明龙生蛭胶囊在降低血脂水平的同时还能够降低 AS 发生过程中产生的炎症反应以及脂质过氧化水平。斑块内血管新生在 AS 的病理生理学机制中起着非常重要的作用，在 AS 斑块早期与晚期受相关因素的影响促进新生血管的形成，但是新生血管容易损伤可能导致斑块内出血引起胆固醇积累和胆固醇结晶，加重血管狭窄［24］。所以新生血管标志物白 细 胞 分 化 抗 原 CD34 和 AS 斑 块 进 展 密 切 相关［25-26］。与模型组比较，龙生蛭胶囊组 CD34 表达量明显降低。F4/80 是常用于标记主动脉中的巨噬细胞的特异性表面抗原，而巨噬细胞的数量和炎症表型都会影响 AS 的发展［27］。本研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠主动脉内膜下 CD34 与巨噬细胞表达量明显升高，血管新生与巨噬细胞均参与AS 的进展。给予中药低、中、高剂量后，各组小鼠主动脉窦巨噬细胞减少，CD34 的表达量也明显减少。提示龙生蛭胶囊可通过抑制斑块内血管新生及减轻主动脉巨噬细胞浸润来改善 AS。综上所述，龙生蛭胶囊对 ApoE-/-小鼠 AS 有一定的干预作用，可以抑制主动脉斑块的形成，该作用的机制可能是通过降低 AS 小鼠血清 TG 和 LDLC 水平来达到降血脂的作用，通过降低 MDA 水平及提高 SOD 活性发挥抑制 AS 发生过程的脂质过氧化水 平 ，通 过 降 低 血 管 CD34、F4/80 表 达 和 血 清 中IL-1β、IL-6 的水平，保护血管免遭受到炎症损伤并减轻主动脉巨噬细胞浸润；以上结果对龙生蛭胶囊抗 AS 的作用提供了一定的研究基础。

来源：医百健康指南