摘要：一直以来，如何将整个基因高效且精准地整合到特定基因组位点，是基因组编辑领域的一个长期存在的难题。尽管现有的基因编辑技术可以修复大多数致病基因突变，然而，许多疾病的遗传多样性（例如，ABCA4基因的 500 多种突变类型会导致Stargardt病，PAH基因的

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2025年05月18日 11:01新加坡

一直以来，如何将整个基因高效且精准地整合到特定基因组位点，是基因组编辑领域的一个长期存在的难题。尽管现有的基因编辑技术可以修复大多数致病基因突变，然而，许多疾病的遗传多样性（例如，ABCA4 基因的 500 多种突变类型会导致 Stargardt病，PAH 基因的 1000 多种突变类型会导致苯丙酮尿症，而 CFTR 基因的 2000 多种突变类型会导致囊性纤维化）导致我们需要设计多种针对特定突变的不同基因编辑疗法，这严重限制了能够受益于基因编辑疗法的患者数量。直接将整个基因整合到基因组中的靶向整合技术，可为功能缺失突变的遗传疾病提供一种不依赖具体突变类型的通用疗法，此外，该技术还可用于癌症免疫疗法、转基因细胞和动物模型构建，以及代谢工程等领域。

2019 年 6 月，张锋团队以及哥伦比亚大学的 Samuel Sternberg 团队各自独立发现了 CRISPR 相关转座酶（CAST），CAST 是一类 RNA 引导的转座酶，能够以高度特异的方式将大片段 DNA 移动到新的位置。而且不会造成 DNA 双链断裂，从而避免了可能产生的不良编辑副产物【1、2】。

CAST 的发现为基因的精准整合奠定了基础，然而，其在人类细胞中的编辑效率不足 0.1%，这么低的效率，显然无法实际应用。

2025 年 5 月 15 日，刘如谦团队与 Samuel Sternberg 团队合作，在国际顶尖学术期刊 Science 上发表了题为：Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase 的研究论文【3】。

该研究利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术来提高 CRISPR 相关转座酶（CAST）的活性，成功进化出了活性提高数百倍的 EvoCAST，能够在人类细胞中实现高效且精准的大片段基因插入，效率相比天然 CAST 提高了 420 倍。EvoCAST 可支持超过 10kb 的超大 DNA 片段整合，并介导了多种治疗性有效载荷在与疾病相关的基因组位点的整合（包括安全港位点、癌症免疫治疗工程位点，以及功能缺失遗传疾病相关基因位点）。此外，EvoCAST 还可在多种人类细胞类型（例如原代人类成纤维细胞）中进行靶向整合，并展现出高产物纯度：未检测到插入或缺失突变（indels），主要为单向插入，整合精度达单碱基对水平，且脱靶整合频率极低。

总的来说，这项研究为 CAST 的实验室进化奠定了基础，并推进了一种在活体系统中实现可编程基因整合的通用系统。

为了提高 CAST 系统的效率，Samuel Sternberg 团队与刘如谦团队合作，利用刘如谦团队于 2011 年开发的 噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，这是一种蛋白质定向进化方法，简单来说，PACE 技术模拟了物竞天择的自然进化筛选过程：首先需要培养多种快速进化的噬菌体，同时对其进行不断稀释，而只有那些表达具有特定理想特征的蛋白变体的噬菌体才能通过比稀释速度更快的复制速度存活下来。

经过数百轮的进化，研究团队成功得到了 CAST 转座酶蛋白 TnsB 的一个进化变体，其在人类细胞中的整合活性提高了 200 多倍。进化后的 TnsB 包含 10 个活性增强突变，这些突变可能调节了其与其他 CAST 组件的多种不同相互作用。值得注意的是，进化后的 TnsB 无需共递送具有细胞毒性的细菌 CAST 辅助蛋白 ClpX 的情况下即可在人类细胞中实现高效整合。研究团队进一步将进化后的 TnsB 变体与其他通过 PACE 进化和理性工程改造的 CAST 组件相结合，得到了 EvoCAST 系统。

进一步验证实验显示，EvoCAST 在人类细胞的 14 个基因组靶点上实现了 10%-30% 的基因整合效率，相比天然 CAST 系统，效率平均提高了 420 倍。EvoCAST 支持 >10kb 的超大片段 DNA 整合，并介导了多种治疗性有效载荷在与疾病相关的基因组位点的整合（包括安全港位点、癌症免疫治疗工程位点，以及功能缺失遗传疾病相关基因位点）。此外，EvoCAST 还可在多种人类细胞类型（例如原代人类成纤维细胞）中进行靶向整合，并展现出高产物纯度：未检测到插入或缺失突变（indels），主要为单向插入，整合精度达单碱基对水平，且脱靶整合频率极低。

PACE 进化而来的 CAST（EvoCAST），可在人类细胞中实现高效、可编程的基因整合

值得一提的是，2024 年 6 月，刘如谦团队利用 PACE 技术对丝氨酸整合酶 Bxb1 进行了数百轮进化，开发出了 eePASSIGE 系统【4】，可实现 10kb 的超大片段 DNA 的高效整合（效率可达 35%）。

刘如谦表示，EvoCAST 与 eePASSIGE 分别基于不同的整合机制，二者具有互补优势，eePASSIGE 的效率更高，但 evoCAST 的编辑纯度更高。此外，eePASSIGE 借助先导编辑器和重组酶，需要两步实现基因整合，而 evoCAST 只需一步，更为简单。

总的来说，这项研究确立了 CAST 作为一种强大的平台技术，能够高效地在人类细胞中实现 RNA 引导的基因整合。evoCAST 的优势包括其简单的可编程性、一步整合机制以及避免 DNA 双链断裂，使其非常适合生命科学研究以及疾病治疗中的许多应用，包括通过一种通用基因编辑疗法解决遗传多样化的患者群体。

更重要的是，该研究展示了如何通过实验室进化将天然存在的系统转化为强大的治疗工具，为改进其他天然存在的 CAST 系统以实现高效基因编辑提供了新策略。

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来源：营养和医学