摘要：1997年引入的基于酵母的展示方法是噬菌体和细菌展示的替代方法，与其他展示系统相比，酵母展示作为真核展示系统的主要优势在于其高效的翻译后修饰(PTM)机制以及更好地适应合成具有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质。通过与酵母细胞壁蛋白的融合，可以在酵母表面展示外源蛋

文章原创：屋中人 文章来源：生物屋 2024年11月25日 06:31 上海

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酵母展示技术概述

1997年引入的基于酵母的展示方法是噬菌体和细菌展示的替代方法，与其他展示系统相比，酵母展示作为真核展示系统的主要优势在于其高效的翻译后修饰(PTM)机制以及更好地适应合成具有多个二硫键的复杂哺乳动物蛋白质。通过与酵母细胞壁蛋白的融合，可以在酵母表面展示外源蛋白。酵母含有200nm厚的细胞壁，由β-聚糖、甘露蛋白和几丁质组成。酵母细胞壁的内表面，通过几丁质连接β-1,3-葡聚糖微原纤维形成一个紧密的骨架层来阻止大分子的渗透，刷状外表面由更多可溶性和支链的β-1,6-葡聚糖和甘露糖蛋白组成。在大多数酵母展示系统中，大多数展示在外细胞壁上的外源蛋白通过GPI与β-1,6-葡聚糖共价结合(糖基磷脂酰肌醇)锚定在它们的C末端。GPI锚定蛋白用于展示Agα1p、Aga2p、絮凝蛋白Flo1p、Cwp1p、Cwp2p、Sed1p、Tip1p、YCR89w和Tir1等异源蛋白。GPI锚定蛋白通过内质网(ER)-高尔基分泌途径转运到酵母细胞表面，并与细胞壁甘露蛋白层形成β-1,6-葡聚糖桥。

所谓酵母表面展示的抗体库技术，就是将抗体分子与酵母膜表面分子融合表达，将抗体分子展示在酵母的膜表面，从而进行快速筛选的技术。酵母的细胞壁由糖蛋白外层和葡聚糖内骨架构成，异源蛋白可以定位于糖蛋白层并与葡聚糖共价连接。根据目标蛋白与酵母糖蛋白交联的类型可以将酵母展示系统分成2种类型：α凝集素目标蛋白和α表面凝集素目标蛋白展示系统。

· α凝集素目标蛋白展示系统是将目标蛋白作为C端与α凝集素Aga2p亚基的N端融合，α凝集素由2个糖蛋白亚单位组成，即Aga1p和Aga2p，其中Aga1p亚单位通过β葡聚糖的的共价连接而锚定在细胞壁上；Aga2p亚单位通过2对二硫键与Aga1p相连，天然的α凝集素结合活性部位在Aga2p的C端，此部分可以用来展示外源蛋白(图5-6)。Aga2p scFv融合蛋白的表达采用GAL1启动子，该启动子在葡萄糖培养基中受到抑制，在含有半乳糖的培养基中得到诱导，从而将scFv展示在细胞表面。

· α表面凝集素目标蛋白展示系统是将目标蛋白作为N端与α凝集素的C端融合，目标蛋白经过α凝集素展示在酵母细胞表面。α凝集素共价连接在细胞壁的葡聚糖上，其锚定能力由蛋白质C端320个氨基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的O 糖基化而拥有一个杆状构象，可作为空间支撑物发挥作用。

虽然各种酵母菌株被用来展示各种蛋白质和肽，但基于Saccharomyces cerevisiae Aga1p-Aga2p的酵母展示系统是最受欢迎的系统，可以从109个转化子的大型文库中分离出目标特异分子。该方法的原理是基于外源蛋白与Aga2p蛋白融合的表达，Aga2p蛋白本身通过与α-凝集素Aga1p蛋白的两个二硫桥固定在细胞膜上，这种附着在酵母表面形成共价复合物，外源蛋白和多肽可以融合到Aga2p的N端或C端，利用该系统，仅在一个酵母细胞表面就可以展示3×104个以上的异源蛋白分子。EBY100作为酿酒酵母工程菌株，可用于Aga1p-Aga2p酵母展示系统。在这种方法中，Aga2p融合蛋白编码在工程质粒中，而Aga1p编码在酵母基因组中。两者都在半乳糖诱导启动子(GAL1)的控制下表达，二硫键的形成确保了Aga1p和Aga2p蛋白的组装。该结构具有额外的标记，包括所需蛋白的N端与Aga2p蛋白之间的血凝素标签(HA)和C端的c-Myc标签(图1)。基于流式细胞仪的方法可以通过针对HA或c-Myc的特异性标记抗体对这些标签进行免疫荧光染色来确认全长蛋白的表达。所需的蛋白可以在酵母Aga2p的C端或N端融合，也可以在Aga2p的C端和N端融合中展示两种不同的蛋白(图1)。

Flo1p作为一种凝集素样蛋白是另一种细胞壁蛋白，通过结合细胞壁甘露聚糖在细胞絮凝中发挥着重要作用，也可用于酵母展示系统。Flo1p蛋白结构由一个负责絮凝的结构域、信号序列和GPI锚定结构域组成，后者促进了蛋白质与细胞壁的结合。在这两种细胞的基础上设计了两种嵌合蛋白的生产方法，Flo1p蛋白的壁固定结构域：

Pir家族细胞壁蛋白成员Pir2p/HSP150p/CCW7p、Pir1p/CCW6p、Pir4p/CCW5p/CCW11p/Cis3p和Pir3p/CCW8p在酵母展示中较少使用。Pir蛋白结构包含两个细胞壁结合位点，而不是GPI锚点附着信号。

除了传统的酵母表面展示外，还设计了一种改进的Nbs筛选平台。在这种方法中，Nb从其C端融合到Aga2p的N端，这种融合导致完全暴露的CDR抗原结合(图2)。正交酰基载体蛋白(ACP)标签用于荧光团(或生物素)的共价附着，可以监测酵母表面表达Nb的展示水平。ACP标签包含一个独特的保守丝氨酸残基，可以与含有荧光团或生物素的辅酶A(CoA)衍生物与Sfp合成酶共价结合，转录受GAL1启动子控制，所展示的Nb可以很容易地通过其生物素标签固定在固体表面上释放和分析。此外，ACP标签可以被其他替代品替代，如SNAP (pNSNAP载体)或S6 (pNS6载体)。

图1. 酵母表面展示示意图。

酵母展示系统最大的优势是可以利用流式细胞仪进行高通量筛选，并且由于酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人抗体蛋白的表达和展示与噬菌体或细菌展示相比更具优越性，酵母本身已在食品生产中得到广泛应用，安全性很好。但是酵母的转化效率低，约为大肠杆菌的万分之一，对于构建大容量的抗体库难度较大；酵母细胞的体积较大，表面抗原非常丰富，可能容易造成标记蛋白与酵母表面分子的非特异性结合。酵母展示抗体库为体外筛选有用抗体提供了一个新的方法，是对噬菌体抗体库的有益补充。

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抗体酵母展示

构建酵母展示抗体文库的基础是将异质免疫球蛋白基因库克隆到酵母展示质粒中，并将克隆的基因与Aga2p蛋白融合表达。通常，抗体片段结合在Aga2p蛋白的C端，但Nb结构体除外。酵母展示系统中使用的大多数抗体格式是scFv；然而，包括Fab、纳米体、单链FAb片段(scFab)和整个IgG在内的其他抗体格式也可以在酵母表面显示。GAL1启动子控制Aga1p的表达和Aga2p-Ab片段融合，酵母展示的抗体片段在半乳糖存在下融合到Aga2p的C端，针对c-Myc或HA标记的免疫荧光标记单抗用于监测该组合复合物的表面密度变化。在酵母展示载体中插入抗体编码基因，得到107-109个变异文库。早期基于酵母展示的研究侧重于现有抗体的亲和成熟，而最近的研究则基于成功分离新生免疫球蛋白，磁活化细胞分选(MACS)和FACS用于酵母展示系统抗体的分离过程(图3)。为了消除流式细胞术率的限制和增加FACS的选择，非结合的mAb片段被MACS消除，MACS预选择通过减少非反应性背景来促进FACS筛选。用c-Myc标签标记用MACS系统选择的酵母细胞，用于同时检测scFv或Fab的表达。

图2.用于纳米抗体筛选的改进酵母表面展示示意图。

03

酵母展示文库构建

利用限制性酶切和基于连接的克隆技术构建抗体基因库，在酵母上展示以启动一抗分离或亲和成熟。由于大多数酵母菌质粒和酵母展示载体在大肠杆菌和酵母中的扩增能力，因此基于连接的克隆利用大肠杆菌获得更高的转化效率，最终的大肠杆菌纯化产物随后转化到酵母表达宿主中。利用真核生物同源重组的间隙修复机制来制备多种酵母基因文库是另一种发展起来的技术，该方法采用PCR生成的抗体基因与表面展示受体载体共转化的方法。一项研究证明了该方法的潜力，酵母展示和同源重组增加了抗肽单链抗体和抗蛋白单链抗体的亲和力。

图3. (A)通过FACS从酵母展示的Ab文库中分离出高亲和力蛋白变体。用Ab基因文库转化酵母细胞并诱导其表面表达。在平移之前，所显示的库根据两条主要路线进行差异标记：i)均衡绑定策略。在这种方法中，配体浓度比预期的最高亲和力KD值高5-10倍，与文库混合孵育；ii)动力学结合策略。在这种方法中，配体如上所述，与文库一起孵育，未结合的配体通过洗涤去除。此外，100倍多余的未标记配体也被用来与该文库孵育。(B) MACS的选择示意图或FACS的库筛选示意图。进行细胞分选和扩展的迭代轮，以丰富来自不同库的稀有粘合剂。MACS恢复细胞扩展为多轮FACS。

为了开发治疗性Fab片段，可以利用酵母杂交同时配对和扩增展示文库中的可变重链和轻链。不同的单倍体酵母可以通过不同的杂交方式表达VL和VH文库，其中在两株菌株的杂交中可以获得109个多样性的Fab文库。在这种方法中，虽然其中一条链已连接到细胞壁锚定结构域，但另一条链必须表达为可溶性蛋白。

严格抑制基因和保持表达基因库的多样性是分离克隆的关键，一个文库的不同克隆间毒性或生长抑制水平的不同可能是由于组成型表达或漏表达的原因。因此，在选择和筛选过程中，快速增长的文库成员将比增长较慢的文库成员具有优势。

04

酵母展示文库的优缺点

三种主要的细胞表面展示系统，包括噬菌体展示、细菌展示和酵母展示。在噬菌体展示系统中，异源蛋白通过附着在丝状噬菌体的外壳蛋白上进行展示。在该系统中，由于噬菌体体积小，所展示蛋白的大小受到限制，然而，可以通过同时表达野生型外壳蛋白和抗体融合外壳蛋白来规避这一问题。

在细菌展示系统中，由于将异源蛋白插入外膜蛋白的暴露环中，感兴趣的蛋白在细菌细胞表面共同展示。然而，这种策略可能会导致外源蛋白的结构破坏，从而降低细菌表面展示的效率，这些问题增加了开发真核显示系统的需求。

酵母作为一种单细胞生物，依靠真核表达机制，熟悉翻译后修饰来表达和折叠复杂的真核蛋白。然而，噬菌体和细菌展示系统中缺乏翻译后系统和错误折叠问题导致工程蛋白，特别是抗体的广泛问题。在酵母表面锚定蛋白的C端或N端插入异源蛋白显然不会破坏表面蛋白的结构，也不会影响表面展示的效率。此外，在酵母中，整个抗体的溶解度得到改善，因为这个宿主可以应用类似于哺乳动物系统的表达系统，如糖基化模式。此外，伴侣蛋白的存在有助于酵母内质网中蛋白质的精确折叠。酵母细胞在FACS中分选的相容性为大型组合表面展示文库的生物物理表征和高通量筛选提供了良好的基础。此外，无需亚克隆、可溶性表达和纯化，就可以用流式细胞术对单个变体进行定量和生物物理表征。将酵母展示系统与流式细胞术相结合，并利用不同的标记方法，包括平衡结合、动态竞争和有限靶标竞争，可以充分和定量地区分与靶标结合亲和力略有不同的变异。然而，酵母显示系统也有一些实际的缺点和局限性，第一个限制是它的库较小(约107-109个个体克隆)，比基于噬菌体和细菌的展示系统获得的库大小低几个数量级。在酵母展示系统中，由于酵母表面存在多个蛋白质支架拷贝，低聚蛋白靶标可能发生不希望的多价结合，这一限制导致分离出具有降低固有朗缪尔结合亲和力的高亲合性结合物。然而，使用动能选择可以避免这种限制。不同的文库展示技术的比较见表2。

参考文献

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3. Hybridoma technology a versatile method for isolation of monoclonal antibodies, its applicability across species, limitations, advancement and future perspectives. International Immunopharmacology. 2020, 85:106639.

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6. Animal Immunization, in Vitro Display Technologies, and Machine Learning for Antibody Discovery. Trends in Biotechnology.2021,39(12): 1263-1273.

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来源：惊喵科学