摘要：除了治疗开发中的主要障碍外，体外 CAR-T 疗法在工业发展和制造过程中也面临重大挑战。首先，在重新给药之前，在体外分离、修饰和扩增 T 细胞的过程耗时且复杂，耗时数周,这一漫长的过程可能不适合需要紧急治疗的癌症快速进展患者。

本文来源于微信公众：知几分子 作者：知几

要说热点，CGT从来都不缺，而且每年版本都有更新，本年度热词：in vivo CAR-T！

当前，细胞治疗公司不提自己正在搞in vivo CAR-T似乎不合群了，会被投资人认为跟不上形势；

众多递送系统公司的LV/AAV/LNP/外泌体技术，如果不提正在考虑赋能in vivo CAR-T，在投资人看来也显得不怎么识时务。

in vivo CAR-T开发需求明确

尽管体外 CAR-T 细胞方法作为抗癌疗法显示出良好的潜力，但许多挑战限制了其治疗效果和安全性。

除了治疗开发中的主要障碍外，体外 CAR-T 疗法在工业发展和制造过程中也面临重大挑战。首先，在重新给药之前，在体外分离、修饰和扩增 T 细胞的过程耗时且复杂，耗时数周,这一漫长的过程可能不适合需要紧急治疗的癌症快速进展患者。

这种制造过程还带来了物流和安全挑战，需要将患者的细胞运输到专门的制造设施并运回。它还具有技术要求高和成本高的特点，因此可能限制了该疗法的广泛可及性。

为解决这些问题，近年来对in vivo CAR-T 细被寄予厚望。

CAR-T 疗法概念扫盲

CAR 是模块化的合成细胞受体，包含四个主要区域：胞外结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域，每个区域都有不同的功能，迄今为止，CAR 已经历了五代演变：

首先，胞外结构域对于靶向识别和结合癌细胞至关重要。该结构域通常来源于单克隆抗体，形成单链可变片段（scFv），使 CAR-T 细胞能够特异性识别癌细胞表面抗原并触发 T 细胞活化。除了 scFv，胞外结构域还可以包括天然配体或突变配体，这些配体经过修饰以增强对癌细胞抗原的结合特异性和亲和力，减少脱靶效应并提高治疗效果。它还可以包括短肽，设计用于靶向癌细胞上的特定表位，作为传统 scFv 的替代方案，提高稳定性和结合特性。

铰链区是 CAR 的第二个结构，是 CAR 胞外结构域和跨膜结构域之间的常见连接区。跨膜结构域通过 T 细胞膜锚定 CAR 构建体。

最后，胞内结构域包含与 T 细胞受体类似的不同信号转导成分，如 CD3ζ、CD28、IL-2 和 4-1BB。该结构域负责触发 T 细胞活化和增殖的胞内信号转导，导致生成专门靶向和杀死癌细胞的新 CAR-T 细胞群。

从机制上讲，当 CAR-T 细胞检测到癌细胞时，两种细胞之间的相互作用激活 CAR 胞内结构域，导致 CAR-T 细胞释放细胞毒性分子并启动癌细胞的死亡机制。

当前体外 CAR-T 疗法的局限性

首先，这种治疗方法存在潜在的副作用，包括细胞因子释放综合征和免疫反应引起的神经毒性。它需要更全面的临床监督和不良事件管理。

其次，随着时间的推移，肿瘤细胞可能会发展出逃避 CAR-T 细胞识别和破坏的机制，导致疾病复发。

第三，如果体外 CAR-T 疗法涉及使用供体细胞（异体细胞），则存在异体移植物排斥的风险。当受体的免疫系统将供体细胞识别为外来物并对其发起免疫反应时，就会产生这种风险，导致移植物排斥。

最后，尽管在特定血液癌症中取得了有希望的结果，但体外 CAR-T 细胞疗法在实体瘤中的疗效仍然有限，因此对其在不同癌症类型中的扩展构成挑战。

in vivo CAR-T 的优势

体外 CAR-T 生产的技术挑战需要发明替代治疗方法，以避免复杂的制造过程并降低成本。最新进展导致了in vivo CAR-T 治疗策略的出现，其中通过使用结合基因编辑工具的递送载体，在患者体内直接将 T 细胞工程化为 CAR-T 细胞。

与体外 CAR-T 疗法相比，in vivo CAR-T 方法具有降低制造成本、缩短周转时间和为患者提供更大便利的潜力。

in vivo CAR-T技术核心：递送系统

体内 CAR 递送需要满足特定标准，包括精确的 T 细胞靶向、高基因编辑效率和低毒性。目前，病毒载体和纳米载体被广泛探索和用于体内 CAR 构建体的递送。

体内 CAR-T 细胞生成中使用的主要病毒类型包括慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒（AAV）。对于体内 CAR-T 细胞生成，这些病毒载体可以通过加入 T 细胞靶向配体进一步工程化，以特异性靶向 T 细胞。这些配体可以通过基因融合到病毒包膜蛋白上，或通过化学偶联连接到病毒载体上。尽管在临床前阶段显示出有希望的结果，但病毒载体由于其脱靶和触发免疫反应的潜力而引起安全问题。

纳米载体在递送遗传物质如 mRNA、质粒和蛋白质以将 CAR 构建体引入体内 T 细胞方面也显示出前景。与病毒载体相比，纳米载体提供最小的脱靶毒性和免疫原性，并且可以大规模制造。此外，纳米载体可以通过与不同的靶向生物材料偶联进行定制设计，以实现靶向能力。此外，它们可以化学偶联和冻干以延长稳定性。

聚合物、脂质和外泌体是用于体内 CAR-T 生成的最常用纳米载体。聚合物的高毒性需要进一步工程化，包括脂质共复合，以减轻毒性并增强功能。脂质纳

米颗粒和外泌体在促进体内 T 细胞重编程方面也显示出前景。其中，外泌体的小尺寸使得有效包装大型基因编辑工具如 CRISPR/Cas9 RNP 变得困难。为应对这一挑战，科学家们探索了各种策略，包括外泌体工程和混合递送系统。

in vivo CAR-T临床进展

EsoBiotech开发的第三代慢病毒载体的ENaBL平台，为癌症和自身免疫性疾病患者提供现成的解决方案。ESO-T01是首个进入临床的in vivo BCMA靶向的CAR-T疗法，针对复发/难治性多发性骨髓瘤（MM）患者，预计ESO-T01的初步临床数据将于2025年下半年公布。

Interius BioTherapeutics慢病毒载体平台，通过CAR基因有效载荷的精确递送，主要候选药物INT2104为靶向CD20的in vivo CAR-T疗法可以直接通过静脉输注给药，而无需预处理化疗，旨在提高患者的可及性并限制脱靶副作用。INT2104被设计用于直接在体内产生CAR-T和NK细胞，应用于治疗B细胞恶性肿瘤，于2024年7月进入临床试验。

Umoja Biopharma 推出了VivoVec™，这是一种创新的表面工程化慢病毒载体，设计用于体内 CAR-T 细胞生成。该系统由表面修饰有多结构域融合蛋白的慢病毒颗粒组成，并携带 CD19 靶向的 CAR 转基因。该平台可以诱导功能性 CAR-T 细胞的有效和特异性生成。

FDA批准了Umoja Biopharma的UB-VV111的临床试验，这是一种旨在在体内产生CD19导向的CAR - T细胞的基因治疗产品，正在进行血液恶性肿瘤的一期剂量升级试验。UB-VV111是Umoja基于其VivoVecTM基因传递平台的首款产品，该平台使用第三代慢病毒载体和T细胞靶向和活化表面复合物，进入临床开发阶段。

EXUMA Biotech已经开发了一种编码 CD19 CAR的慢病毒载体，用于靶向和激活人源化 NSG-SGM3 小鼠模型中的 CD3+ T 细胞。他们的临床前数据显示，体内编辑 CD3+ T 细胞可以产生功能性 CAR-T 细胞，同时消除现有的 B 细胞。

除了病毒载体，基于纳米颗粒的体内 CAR-T 疗法的工业进展也取得了重大进展。Ensoma 开发了病毒样颗粒 Engenious™平台，以递送包装 DNA 高达 35 千碱基，这是 AAV 载体限制的七倍多。

Capstan Therapeutics 通过使用 mRNA - tLNP平台，在体内 CAR-T 生成期间使用 CD8靶向LNP来封装靶向CAR- mRNA 分子，首发管线靶点为CD19，用于自免疾病。

in vivo CAR-T开发的挑战

尽管数据有希望，in vivo CAR-T 疗法仍面临自身的技术挑战。主要问题是有效地将 CAR 转基因递送到体内的靶向 T 细胞。

病毒载体由于其固有的病毒特性，促进细胞摄取和核渗透，具有高基因转导效率。然而，直接向患者输注携带 CAR 构建体的病毒载体具有有限的靶向能力。此外，这种方法还存在脱靶效应的风险，其中其他细胞类型可能被无意转染而不是靶向的 T 细胞。

为解决这一问题，研究人员专注于工程化专门靶向 T 细胞的病毒载体。例如，Jesse Green 等人通过工程化融合蛋白与靶向人 CD8+ T 细胞的新型单链可变片段，开发了 T 细胞靶向病毒载体。这些工程化载体表现出选择性靶向和转导非活化 CD8+ T 细胞的能力，这些 T 细胞可以在体外和体内环境中消除表达 CD19 的肿瘤。

鉴于基于病毒载体的疗法的风险和高生产成本，纳米载体平台似乎更适合体内靶向 T 细胞。它们的表面可以与靶向 T 细胞高表达受体的配体偶联。迄今为止，常用的受体包括 CD3、CD4、CD7 和 CD8 等一般 T 细胞标志物，在设计 T 细胞靶向策略时可以考虑这些标志物。此外，需要进一步研究以增强这些纳米颗粒在生物环境中的稳定性和生物相容性。这对于防止在有效到达和靶向 T 细胞之前降解和潜在的不良反应至关重要。

纳米载体的另一个主要问题是其有限的转染效率，当用于体内基因转染包括 CAR 构建体时，这一点更加明显。即使是临床使用的脂质纳米颗粒，在进入细胞质之前，它们从内体 / 溶酶体区室逃逸的能力也非常有限，这可能导致溶酶体内遗传货物（如 mRNA）的酶促降解。为解决这一问题，已经开发了各种策略，包括使用 pH 响应纳米载体和加入触发逃逸机制的成分，如孔形成蛋白或肽。

实现体内 CAR-T 细胞的持续功能和持久性是优化癌症患者治疗效果的另一个关键问题。研究人员正在探索各种策略来克服这一挑战。一种方法涉及通过加入增强 T 细胞寿命和活性的共刺激结构域来优化 CAR 设计。使用共刺激结构域调节 CAR-T 细胞内的细胞内信号通路可以延长其功能。还研究了防止 T 细胞耗竭的策略，如检查点抑制或细胞因子支持。此外，已努力促进记忆 CAR-T 细胞的形成，使体内 CAR-T 细胞在血液和实体恶性肿瘤中具有持久的抗肿瘤反应。

与体外 CAR-T 疗法类似，用于实体瘤的体内 CAR-T 细胞疗法与血液恶性肿瘤相比更具挑战性。实体瘤通常表现出免疫抑制性肿瘤微环境，可抑制 T 细胞活性，从而降低 CAR-T 疗法的疗效。增强实体瘤疗效的一种策略涉及通过靶向和化疗药物联用的策略，改善 CAR-T 细胞向肿瘤部位的归巢。

此外，实体瘤中抗原的异质性给 CAR-T 细胞带来了挑战，阻止它们有效识别癌细胞并显著限制其抗肿瘤功能。这一问题与体内针对各种肿瘤相关抗原的 CAR-T 细胞产生不足有关，从而导致 CAR-T 疗法对实体瘤的疗效有限和疾病复发的发生。为应对这一挑战，已探索了几种方法，如在单个 T 细胞上共表达几种 CAR，以及表达包含两个或更多抗原识别结构域的嵌合受体。

目前in vivo CAR-T主要围绕血液肿瘤和自免疾病进行探索，但TCE双抗也恰在此处发力，体内CAR-T能否胜出？一句话：道阻且长。

来源：小茗茗唠车