Science丨David Liu、Samuel Sternberg开发基因剪刀升级版：精准送达治疗大片段DNA

摘要：基因编辑技术的快速发展为遗传疾病的治疗带来了革命性突破， CRISPR-Cas9 核酸酶、碱基编辑器和先导编辑器等技术已能够精确修改基因组中的短片段 DNA 序列，并在临床治疗中展现出显著效果。然而，这些技术在哺乳动物细胞中实现大片段基因（ ≥1 kb ）的靶

撰文|易

基因编辑技术的快速发展为遗传疾病的治疗带来了革命性突破， CRISPR-Cas9 核酸酶、碱基编辑器和先导编辑器等技术已能够精确修改基因组中的短片段 DNA 序列，并在临床治疗中展现出显著效果。然而，这些技术在哺乳动物细胞中实现大片段基因（ ≥1 kb ）的靶向插入仍面临重大挑战。许多遗传疾病，如囊性纤维化、 Stargardt 病和血友病 B ，具有高度异质性的突变谱，使得基于核酸酶或碱基编辑的疗法难以覆盖所有患者。传统的病毒载体基因疗法虽然能够递送功能性基因拷贝，但存在插入突变风险、免疫原性以及表达调控不精准等问题。因此，开发一种无需 DNA 双链断裂（ DSB ）、高效且精准的大片段基因插入技术，对于实现 “ 突变无关 ” 的基因治疗至关重要。

近日，哈佛大学 David R Liu 和哥伦比亚大学Samuel H Sternberg联合在 Science 期刊上发表题为

Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase的研究论文，通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术成功开发出高效evoCAST系统，在人类细胞中实现了10-30%的千碱基级DNA精准整合，为基因治疗提供了突破性的工具。

CRISPR相关转座酶（CASTs）是一类源自细菌的 RNA 引导转座系统，能够通过 Tn7 样转座酶实现大片段 DNA 的靶向整合。尽管 I-F 型 CASTs 在细菌中表现出高效性和高特异性，但在人类细胞中的活性极低，这可能是由于转座酶催化效率不足或与哺乳动物细胞环境的兼容性较差。作者采用噬菌体辅助连续进化（ PACE ）技术对 PseCAST 的转座酶模块（ TnsABC ）进行定向进化。 PACE 通过将转座活性与噬菌体 M13 的复制必需基因 gIII 的表达偶联，在连续传代中筛选高活性突变体。具体实验设计包括构建进化回路，将 TnsABC 编码于噬菌体基因组，并在宿主大肠杆菌中引入辅助质粒（ CP1 和 CP2 ），通过转座事件激活 gIII 表达。通过多轮进化（ PACE 和 PANCE 交替进行）逐步提高转座效率，并优化回路设计以避免 “ 作弊 ” 突变，聚焦于 TnsB （催化核心）的进化，结合 AlphaFold3 结构预测分析关键突变对催化效率的影响。最终，将进化后的 TnsB （ P4-15 ）与工程化 DNA 靶向模块（ QCascade ）结合，构建出优化的 evoCAST 系统。

研究结果表明 evoCAST 系统在人类细胞中展现出卓越的基因整合能力，其性能在多方面超越了现有的基因编辑工具。在 HEK293T 细胞中， evoCAST 实现了 10-30% 的整合效率，平均达到 14% ，这一数值较野生型 PseCAST 提高了超过 200 倍。值得注意的是，这种高效率并非局限于特定细胞系或特定基因组位点，而是在 14 个不同测试位点（包括 AAVS1 安全港位点、 TRAC 免疫治疗位点以及多个疾病相关基因位点）都表现出稳定的高整合效率。这种广谱高效性使其在治疗应用上具有显著优势。

高通量测序分析显示， evoCAST 介导的整合事件具有极高的位点特异性。与传统的 CRISPR-Cas9 系统不同， evoCAST 在整合过程中不会产生可检测的插入缺失突变，这一特性对于临床应用至关重要，因为它大大降低了因编辑错误导致的安全风险。此外， evoCAST 的整合具有明确的方向偏好性，在测试的四个基因组位点中，约 90% 的整合事件都保持一致的插入方向。通过改进的 UDiTaS 全基因组分析方法，作者发现 evoCAST 的脱靶整合频率低于 3% ，且所有检测到的脱靶事件均为单次独立事件，没有发现重复出现的脱靶热点。

evoCAST 的另一个显著优势是其对不同细胞类型的广泛适用性。除了在 HEK293T 细胞中的优异表现外，在 HeLa 和 K562 细胞系中， evoCAST 分别实现了 4.7% 和 1.6% 的整合效率。更重要的是，在原代人类成纤维细胞中， evoCAST 达到了 19% 的高整合效率，这为其在临床治疗中的应用提供了有力支持。

作者进一步测试了 evoCAST 在治疗应用方面的潜力。在肝细胞系中， evoCAST 成功将凝血因子 IX （ F9 ） cDNA 整合到 ALB 基因内含子 1 中，效率达到 5.7% ，并检测到功能性蛋白表达。在 T 细胞治疗领域， evoCAST 在 TRAC 位点实现了 13% 的 CD19 CAR 整合效率。特别值得注意的是， evoCAST 在多个遗传病相关基因位点（包括 FANCA 、 IL2RG 、 MECP2 和 PAH ）都实现了 12-15% 的治疗性 cDNA 整合效率，这种 “ 突变无关 ” 的治疗策略可以覆盖同一基因的不同突变类型患者。

综上所述，本研究通过噬菌体辅助连续进化（PACE），获得了平均整合活性提升200倍以上的CAST变体。进化后的CAST系统（evoCAST）在人类细胞中14个测试基因组位点实现了约10%至30%的千碱基级DNA片段整合效率，且未检测到插入缺失突变（indels），脱靶整合水平较低。evoCAST的成功开发标志着基因编辑技术在大片段DNA精准整合方面取得了重大进展，为治疗多种遗传疾病开辟了新的可能性。

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