Molecular cell丨复制叉稳定的结构基础：BRCA2的羧基端参与维持复制叉稳定性

摘要：BRCA2 由 3,418 个氨基酸构成，其突变易导致激素驱动型肿瘤和血癌。其中，最常见的突变导致羧基末端蛋白断裂【1，2，3，4，5】。 BRCA2 肿瘤抑制功能的研究主要集中在维持基因组稳定性方面，包括（ 1 ）在 G2 细胞周期阶段，支持同源定向修复（

撰文丨我的闺蜜老红帽

BRCA2 由 3,418 个氨基酸构成，其突变易导致激素驱动型肿瘤和血癌。其中，最常见的突变导致羧基末端蛋白断裂【1，2，3，4，5】。 BRCA2 肿瘤抑制功能的研究主要集中在维持基因组稳定性方面，包括（ 1 ）在 G2 细胞周期阶段，支持同源定向修复（ HDR ）的 DNA 双链断裂（ DSB ）修复途径，（ 2 ）在 S 期，保护复制叉（ FP ）的 DNA 复制稳定【6，7】。然而， FP 和 HDR 在基因上是可分离的，因此， BRCA2 羧基末端和 RAD51 相互作用对 FP 是必需的，而对 HDR 则不是。由于人类癌症中，三分之二的突变很可能是由复制错误造成的，因此，深入研究 BRCA2 羧基末端在复制叉中的作用极为重要。

在没有中间介质的情况下， RAD51 二聚体可以在单链 DNA （ ssDNA ）和双链 DNA （ dsDNA ）上结合。由于 RAD51 寡聚化成螺旋细丝，在柔性 dsDNA 上的组装比在刚性 dsDNA 上的组装更快。在 HDR 激活、 ATP 充足的情况下， ssDNA 上延伸的核蛋白丝通过暴露更多 DNA 碱基来实现碱基同源性搜索。 ATP 水解，使得 RAD51 处于与 ADP 结合的 “ 压缩 ” 形式，促进 RAD51 从 DNA 上解离。然而， RAD51 核蛋白丝复合物的核苷酸结合状态之间的相互作用，如何影响它们在 HDR 和 FP 中的不同功能一直是谜。

近期，来自美国 UT MD Anderson Cancer Center 的Katharina Schlacher研究组在Molecular cell上发表题为BRCA2 C-terminal clamp restructures RAD51 dimers to bind B-DNA for replication fork stability的文章，通过详细的结构和分子分析，发现BRCA2羧基端TR2是一个关键的抑癌因子，可以重塑B-DNA结合的RAD51二聚体。

BRCA2 通过两种不同的机制与 RAD51 重组酶相互作用：（ 1 ）人类 BRCA2 的外显子 11 所编码的 8 个保守的 BRC 重复序列；（ 2 ）外显子 27 所编码的保守的羧基末端 RAD51 识别结构域（ TR2 ），该结构域与 BRC 重复序列缺乏同源性。这 8 个 BRC 重复序列的主要功能是使 RAD51 丝在 ssDNA 上的成核（ BRC1-4 ）和稳定（ BRC5-8 ）生长，同时抑制 dsDNA 的结合。相反， TR2 通常被认为是用于寡聚体 RAD51 稳定组装到 ssDNA 上的。因此，上述相互作用最低限度需要含有 36 个残基的多肽。

为了研究 TR2-RAD51 相互作用如何区分 FP 和 HDR ，作者在 2.7 A ˚ 分辨率下解析了 TR2-RAD51 的 x 射线晶体结构，并且展示了 TR2 界面（ TR2 interface ， TR2i ）配体与 ATP 类似物结合的 RAD51 二聚体。这一解析是在没有 DNA 的情况下，通过 x 射线晶体结构的原子细节来实现的，也就是说，展示了成核到结合到 DNA 上之前到状态。

接下来，作者将结构解析结果与细胞和分子突变分析相结合，确定 BRCA2 TR2i 可以作为一套变构钳，将 RAD51 二聚体重塑为前所未有的构象。改变 RAD51 DNA 底物特异性，可以加强 ds 和 B-DNA 的结合。这一发现定义了 TR2i 在维持复制叉稳定性中的作用，并区分了其在 FP 和 HDR 中的生物物理作用。

BRCA2 S3291/P3292 是细胞周期依赖性激酶（ CDK ）的磷酸化位点。最后作者还发现，脯氨酸驱动的二级结构稳定了残基三联体，并跨越了 RAD51 二聚体，参与了 RAD51 M210 和 BRCA2 S3291/P3292 的关键相互作用。并且，在 S 期与 FP 相互作用，在 G2 期则与 HDR 相关。

综上所述，作者通过分子生物学干预和精细结构解析，发现BRCA2的羧基端TR2区域重塑了RAD51二聚体，使其能够结合B-DNA，且这一结合方式不会启动DSB修复，但可以维持复制叉稳定性。作者的工作改变了学界对BRCA2如何完成两个相互排斥的RAD51加载功能的理解，并展示了BRCA2在维持复制叉稳定性中的核心作用。

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