摘要：你是否曾惊叹于壁虎断尾、海星断臂后依然能够完整再生的神奇能力？而在脊椎动物中，蝾螈（Axolotl, Ambystoma mexicanum）更是再生领域的“超级英雄”，它们不仅能再生四肢、尾巴，甚至包括下颌、眼睛等复杂器官。这种令人难以置信的再生能力，并非简

你是否曾惊叹于壁虎断尾、海星断臂后依然能够完整再生的神奇能力？而在脊椎动物中，蝾螈（Axolotl, Ambystoma mexicanum）更是再生领域的“超级英雄”，它们不仅能再生四肢、尾巴，甚至包括下颌、眼睛等复杂器官。这种令人难以置信的再生能力，并非简单的细胞增殖，而是一个高度协调、精密的模式形成过程。其核心在于细胞所携带的“位置记忆”（positional memory）——关于它们在身体前-后（anterior-posterior, AP）、近-远（proximal-distal）、背-腹（dorsal-ventral）轴上位置的固有信息。正是这些“记忆”，指导着肢体截断后形成的再生芽（blastema）精确地重建缺失的部分，确保新生的肢体与残端完美契合。

然而，长久以来，研究人员一直被一个核心问题所困扰：这些精妙的位置记忆是如何在细胞中稳定维持的？它们是像刻在石头上的印记一样永恒不变，还是可以被重新“编程”（reprogrammed）和“擦写”？如果能改变，那将意味着什么，又能如何应用于未来的医学？最近，5月21日发表在《Nature》上的突破性研究“Molecular basis of positional memory in limb regeneration”，为我们揭示了蝾螈肢体再生中“位置记忆”的分子密码，给出了令人振奋的答案！

该研究首次揭示了一个关键的正反馈循环（positive-feedback loop）——由Hand2转录因子（transcription factor）与Shh（Sonic Hedgehog）信号共同构成，它不仅负责维持后侧细胞的固有身份，更令人震惊的是，它还赋予了科学家们“重写”前侧细胞位置记忆的可能。这项发现不仅极大地深化了我们对再生生物学基本原理的理解，更为未来的组织工程（tissue engineering）、再生医学，甚至实现“肢体打印机”的梦想，打开了前所未有的窗口。

谁是幕后“英雄”？Hand2的崛起

过去，人们曾认为肢体再生的Shh信号可能主要来源于胚胎时期就表达Shh的细胞。那么，这些“胚胎Shh谱系”细胞是否在整个生命周期中都持续存在，并在受伤后充当Shh信号的唯一来源呢？

研究人员利用ZRS>TFP转基因蝾螈（一种在Shh肢体增强子ZRS驱动下表达TFP荧光蛋白的蝾螈）进行遗传谱系追踪，发现了一个惊人的结果：在肢体再生过程中，绝大多数表达Shh的再生细胞（TFP阳性）并非来自胚胎Shh谱系（mCherry阴性），它们之间的荧光信号重叠度仅为23.1% ± 22.1%。这明确表明，有许多非胚胎Shh谱系的细胞在再生时能够“开启”Shh的表达。为了进一步验证，研究人员甚至通过手术清除了胚胎Shh谱系细胞，实现了高达88.7% ± 6.1%的清除率，但这些肢体仍然能够正常再生，且再生时间与对照组相似。这有力地证明，胚胎Shh细胞对于再生时表达Shh并非必不可少，后侧位置信息并非仅限于胚胎Shh细胞。

既然如此，是谁在再生时“启动”了Shh的表达，并储存了这种后侧位置信息呢？

为了寻找这些“启动者”，研究团队对蝾螈前侧和后侧皮肤结缔组织细胞（这些细胞被Prrx1+基因标记，是位置记忆的强大载体）进行了转录组（transcriptome）测序和比较分析。结果显示，前侧和后侧细胞之间约有300个基因存在显著差异表达（DESeq2分析，P值小于0.01）。在这些差异表达基因中，一个名为Hand2的转录因子（transcription factor）脱颖而出，其在后侧细胞中的表达水平最高，统计学意义也最为显著。Hand2编码一个bHLH（基本螺旋-环-螺旋）转录因子，已知在小鼠、鸡和斑马鱼的肢体芽发育中于后侧表达并诱导Shh。这提示Hand2可能在蝾螈的后侧位置记忆中扮演关键角色。

更进一步的分析显示，除Hand2外，后侧细胞还特异性表达Hoxd13和Tbx2等转录因子，而前侧细胞则表达Alx1、Lhx2和Lhx9等基因，这些都与发育中肢体的AP轴模式一致。GO分析也发现，差异表达基因富集于“细胞外基质”（extracellular matrix）和“细胞黏附”（cell adhesion）等类别，暗示前侧和后侧肢体可能存在不同的信号微环境。

为了追踪Hand2在蝾螈肢体中的动态，研究人员构建了Hand2:EGFP敲入（knock-in）蝾螈，使其内源性Hand2基因与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）融合表达。结果显示，Hand2:EGFP在蝾螈肢体的后侧细胞中持续表达：从肢体芽（limb bud）、未受伤肢体到再生芽（blastema）均可观察到。有趣的是，在肢体再生过程中，Hand2:EGFP的荧光强度显著增加，达到基线水平的5.9 ± 0.4倍；在Shh表达启动前（再生第7天），Hand2:EGFP的荧光强度也增加2.3 ± 0.2倍。这表明Hand2在再生启动阶段被上调。

谱系追踪进一步证实，胚胎Hand2谱系细胞贡献了蝾螈前肢的后半部分和手部的2.5个指头，与Hand2的活跃表达模式吻合。这些胚胎Hand2细胞在成年期和再生时都被保留。通过3D成像，研究人员清晰地看到，Hand2谱系细胞确实能够产生Shh表达细胞。所有这些证据都强烈指向Hand2是调控蝾螈后侧身份和Shh表达的关键因子。

Hand2与Shh：一个不解之缘的“爱情故事”

那么，Hand2与Shh之间究竟是怎样的关系？Hand2是必需的吗？它足以决定后侧身份吗？

Hand2的“必要性”

研究人员利用CRISPR-Cas9技术敲除了Hand2的翻译起始密码子（translational start codon），生成了Hand2 CRISPants蝾螈。结果令人震惊：这些CRISPants蝾螈的致死率高达52%，远高于对照组的14%。在存活的Hand2 CRISPants蝾螈中，45%的肢体出现了指头数量或向外生长缺陷（n=50/112肢体），例如有9/112个肢体在肩带以外没有形成任何新的部分，这与Shh CRISPants蝾螈的表型相似。在肢体截肢后，几乎所有Hand2 CRISPants蝾螈再生的指头都更少，包括那些原本指头数量正常的肢体。

更重要的是，Hand2 CRISPants蝾螈的ZRS>TFP+细胞数量减少，或TFP表达减弱，这表明Hand2对Shh的表达是必需的。TFP信号强度与肢体发育缺陷程度呈直接负相关（斯皮尔曼等级相关系数0.74，P值为2.40 × 10-3）。

为了功能性地验证Hand2在后侧身份中的作用，研究人员使用了辅助肢体模型（Accessory Limb Model, ALM）。在此模型中，如果将后侧皮肤移植到前侧伤口，会诱导额外肢体形成。Hand2突变的后侧皮肤未能诱导额外肢体（0/6次手术），而对照组的后侧皮肤成功诱导了额外肢体（3/6次手术）。这明确证实Hand2是后侧身份形成所必需的，至少在诱导Shh表达方面。

Hand2的“充分性”

如果Hand2是必要的，那么它是否也足以诱导Shh表达和后侧身份呢？

研究人员构建了能在肢体芽和再生芽间充质（mesenchyme）中广泛表达mCherry-Hand2融合蛋白的转基因蝾螈。结果发现，Hand2的异位表达（misexpression）足以诱导异位ZRS>TFP（Shh报告基因）表达（7/9个肢体芽中观察到），并导致多指畸形（7/16个肢体）。在两种极端情况下，Hand2异位表达甚至诱导了异位肢体（2/16个病例），这在其他物种中尚未报道，但与蝾螈在AP轴不连续处形成肢体的能力一致。

当Hand2在结缔组织细胞中均匀表达时，观察到肢体向外生长受阻，形成不完整的肢体或仅为尖刺状结构。这可能是因为Hand2的广泛表达使得整个肢体场（limb field）都“后侧化”了，消除了肢体向外生长所需的前后不连续性。相比之下，Hand2弱表达的同窝动物则呈现正常的肢体形态。这种“强”与“弱”Hand2表达之间约两倍的差异，与Hand2在Shh表达前增加2.39倍的现象相似，进一步暗示Hand2的表达水平对Shh诱导至关重要。

为了从分子层面证实Hand2诱导的后侧化，研究人员对Hand2异位表达的再生芽前侧细胞进行了RNA测序。结果显示，Hand2异位表达细胞显著上调了后侧转录因子（如Hand2、Hoxd13、Klf8），并下调了前侧转录因子（如Lhx2、Lhx9、Barx1、Zfhx4、Hoxc10）。这与后侧化的基因表达特征完全一致。

功能性验证也支持了这一点：将强Hand2异位表达的前侧皮肤移植到神经支配的前侧伤口，能够上调ZRS>TFP报告基因，并诱导额外肢体形成（8/8次移植均成功）；而弱Hand2异位表达的皮肤则没有这种效果（0/8次）。

综上所述，Hand2在蝾螈肢体再生中不仅是后侧身份的必需因子，其异位表达也足以诱导Shh表达、导致多指畸形和异位肢体，并使前侧皮肤后侧化。

记忆可以“擦除”和“重写”吗？

肢体前-后轴的位置记忆在胚胎发育后是否就不可逆转地固定下来了呢？这是再生生物学领域的一个核心问题。

为了探索细胞身份的可塑性，研究团队设计了一个巧妙的移植实验：将前侧或后侧细胞移植到未标记宿主肢体的相对侧，随后进行截肢并观察其位置记忆的变化。他们为此构建了Alx4:mCherry_Hand2:EGFP双报告基因蝾螈，其中Alx4:mCherry标记前侧细胞，Hand2:EGFP标记后侧细胞。在未受伤的肢体中，Alx4:mCherry和Hand2:EGFP分别主要表达于疏松结缔组织、关节、骨骼和骨膜周围结构。

前侧到后侧（A→P）的转变

研究人员将纯化的前侧细胞（mCherry+/EGFP-）注射到未标记宿主肢体的后侧。两周后，这些细胞在未受伤肢体中仍然保持mCherry表达，这与前侧身份的稳定性一致。然而，在肢体截肢后，移植的细胞进入再生芽，并在再生第8天开始表达EGFP+，表明它们已经“后侧化”了。令人惊喜的是，当肢体完全再生后再次截肢时，这些被“后侧化”的移植细胞仍然能够表达Shh，这进一步证明了位置记忆在经过一个再生周期后被稳定地“后侧化”了。

RNA测序分析揭示了这种身份转换的分子机制：前侧移植细胞（A→P组）与后侧细胞（P组）的转录组更为相似，而与前侧细胞（A组）或对照前侧移植细胞（A→A组）不同。A→P移植细胞显著下调了60.1%的前侧再生芽特异性基因，并上调了22.5%的后侧再生芽特异性基因。这意味着移植细胞失去了原有的前侧身份，并获得了后侧身份。值得注意的是，前侧标记基因（如Pbx3、Dmrt2、Hoxc10）的丢失是A→P移植特有的，而非简单的移植假象。

后侧到前侧（P→A）的抵抗

在反向实验中，研究人员将纯化的EGFP+后侧细胞注射到前侧。这些移植的后侧细胞稳定保留了EGFP表达，不仅在未受伤肢体中如此，在再生过程中也保持不变，并导致了异位模式的再生肢体。在第二次截肢后，这些标记细胞依然表达Shh，进一步反映了后侧记忆状态的维持。研究中未检测到任何前侧化（仅mCherry阳性）的细胞。

这些结果共同揭示了一个关键发现：蝾螈再生芽中的位置记忆是可塑的，但存在方向上的不对称性。前侧细胞在再生过程中更容易转化为后侧记忆状态，而后侧细胞则难以“前侧化”，倾向于保留其原始的后侧记忆。这体现了一种“后侧优势”（posterior dominance），与Hox基因在肢体发育中后侧基因表达更具主导性的情况有异曲同工之妙。

临门一脚：Shh的“记忆重塑”能力

那么，前侧细胞向后侧记忆状态的转变是如何发生的呢？研究人员推测，这是因为移植的前侧细胞暴露于内源性后侧细胞分泌的Shh信号。

为了验证Shh在“记忆重塑”中的作用，研究团队在进行A→P移植实验的同时，使用Shh信号通路抑制剂BMS-833923处理蝾螈。结果表明，这种抑制剂能够阻止前侧细胞的后侧化（表现为Hand2:EGFP表达缺失）。这证实了内源性Shh信号是移植细胞后侧化的关键驱动力。

如果内源Shh可以诱导后侧化，那么外源Shh信号是否足以“重写”前侧细胞的位置记忆呢？

研究人员将编码Shh的杆状病毒（baculovirus）注射到蝾螈肢体的前侧。结果显示，被感染的前侧细胞局部诱导了Hand2:EGFP的表达。这说明前侧再生芽细胞对Shh信号是响应的。

最关键的实验是体内（in vivo）的瞬时Shh信号处理。研究人员利用Hand2谱系追踪蝾螈（能稳定标记后侧细胞），在肢体芽锥形阶段（cone stage）腹腔注射Shh信号激动剂SAG（Smooth ened Agonist），使前侧再生芽细胞短暂暴露于Shh信号。结果发现，前侧再生芽细胞获得了Hand2:EGFP表达，成功地被“后侧化”了！更令人兴奋的是，当肢体完全再生后再次截肢时，这些经过SAG处理的再生芽细胞，在新的再生芽中依然能够异位表达Shh，并持续表达Hand2。这表明，瞬时、短期的Shh信号足以“启动”一个异位的Hand2-Shh正反馈循环，从而导致Hand2的稳定表达，并赋予前侧细胞持久的Shh表达能力，最终将前侧位置记忆稳定地“写入”为后侧记忆。

未来的“肢体打印机”：再生医学新愿景

这项突破性研究揭示了蝾螈肢体再生中一个精妙的分子机制：Hand2-Shh正反馈循环。这个循环不仅负责维持后侧细胞的身份，而且在再生过程中充当了位置记忆的“稳定器”和“重编程器”。

位置记忆的维持： 手术截肢后，Hand2在后侧再生芽细胞中表达上调，并诱导Shh表达。Shh信号反过来刺激附近的再生芽细胞，使其获得后侧记忆（包括Hand2表达）。当再生完成时，Shh信号被关闭，但Hand2的表达得以维持，从而“守护”着后侧记忆的稳定性。

位置记忆的可塑性：前侧细胞在再生过程中暴露于Shh信号时，可以相对容易地转化为后侧记忆状态。这解释了为什么前侧到后侧的身份转换更容易实现。而一旦细胞获得了后侧记忆，它们就倾向于稳定保持，即使移植到前侧区域也很难被“前侧化”，体现了后侧在位置信息传递中的“优势”。

Shh的“重塑”能力：短暂的Shh信号足以“重写”前侧再生芽细胞的位置记忆，将它们永久性地转化为后侧记忆细胞。这就像Shh提供了一个“记忆擦除并重写”的功能，为再生医学的未来奠定了基础。

这项研究不仅加深了我们对蝾螈再生机制的理解，更提供了操控再生细胞命运的全新思路。通过精准调控Hand2-Shh循环，我们或许能够：

控制再生方向和结果：人为地诱导或抑制特定位置记忆的形成，从而指导肢体或器官的再生，避免畸形或促进完整修复。

推动组织工程发展：将“位置记忆”机制应用于干细胞和组织工程领域，指导体外培养的细胞形成具有正确空间信息的复杂组织结构，从而实现真正的“肢体打印机”梦想。

理解发育与再生： 蝾螈Shh谱系比小鼠更广泛的发现，也为我们理解脊椎动物肢体发育的演化过程提供了新的视角。

当然，这项研究也提出了一些新的问题，例如，如何避免过度后侧化？在再生过程中，前侧与后侧细胞如何协调以确保完整模式的形成？以及如何将这些发现转化为适用于人类的再生疗法？

未来的研究将继续探索这些奥秘，但这项工作无疑是再生生物学领域的一个里程碑。它让我们离“重塑生命，打印未来”的科幻愿景又近了一步。希望在不久的将来，这些基础科学的突破，能够真正应用于临床，为那些饱受肢体缺失或功能障碍困扰的人们带来新的希望！

参考文献

Otsuki L, Plattner SA, Taniguchi-Sugiura Y, Falcon F, Tanaka EM. Molecular basis of positional memory in limb regeneration. Nature. 2025 May 21. doi: 10.1038/s41586-025-09036-5. Epub ahead of print. PMID: 40399677.

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来源：生物探索一点号1