技术分享丨鸡肠炎专题（二）——丁酸梭菌调控坏死性肠炎的机制

摘要：一般认为，A型、C型或G型的产气荚膜梭菌在肠道内大量增殖是引起鸡坏死性肠炎的主要原因。产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens）是革兰氏阳性的厌氧芽孢杆菌，两端钝圆，常呈单个或成对出现，无鞭毛，有夹膜，在严峻的

01鸡坏死性肠炎诱发因素

1、主要因素

一般认为，A型、C型或G型的产气荚膜梭菌在肠道内大量增殖是引起鸡坏死性肠炎的主要原因。产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens）是革兰氏阳性的厌氧芽孢杆菌，两端钝圆，常呈单个或成对出现，无鞭毛，有夹膜，在严峻的环境中可形成芽孢，芽孢一般呈卵圆形，位于菌体中央或近端。产气荚膜梭菌在自然界分布广泛，土壤、污水、粪便以及人畜肠道中都有存在，并常污染人类食物（尤其是动物性食品）和动物饲料。产气荚膜梭菌不但能引起不同动物的气性坏疽、肠毒血症或坏死性肠炎等30多种疾病，它也能引起气体坏疽和人的食物中毒等多种疾病，具有非常重要的公共卫生学意义，是CDC列出的人最常见5种主要食源性感染/中毒的病原体之一。

产气荚膜梭菌作为一种条件致病菌正常存在于健康动物肠道中，如在健康鸟类肠道中，产气荚膜梭菌浓度为-CFU/g消化物。但当肠道发生损伤，肠道微生态被打破，导致肠道内微生物群落的共生平衡发生改变时，会引起产气荚膜梭菌的大量增殖，上升到-CFU/g消化物。产气荚膜梭菌的主要致病机制是在一定条件下大量生长并释放出多种外毒素，产气荚膜梭菌的致病性及致病力几乎完全由其毒素产生能力而决定，并由此而导致在不同的宿主体内表现特殊疾病和形式。

2、诱发因素

作为一种条件致病菌，诱导产气荚膜梭菌大量增殖导致坏死性肠炎的主要因素包括以下几个方面。

（1）球虫感染

一般认为鸡球虫病和鸡坏死性肠炎是伴发的两种病。鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫同时或先后寄生于鸡肠道上皮细胞而引起的养禽业中常见的一种疾病，本病在世界各地普遍发生，几乎所有日龄的鸡均易感，对雏鸡和育成鸡的危害十分严重。球虫感染首先会物理性的破坏肠黏膜的完整性，同时球虫在入侵肠上皮细胞时会产生许多外源性毒素（如在产气荚膜梭菌粘附中起作用的胶原酶），球虫入侵还可能使血浆蛋白泄漏到肠腔中而增加肠黏膜通透性，为产气荚膜梭菌的生长提供了营养。

（2）饮食结构

饮食结构是导致鸡坏死性肠炎的另一个诱因。在喂养过程中非玉米饲料，如小麦、黑麦等，因富含非淀粉多糖导致肠道内食糜黏度增加，使饲料通过肠道的时间延长，同时，由于饲料黏度增加，动物大量饮水，导致肠道内环境潮湿，为产气荚膜梭菌的增殖提供了生长环境，垫料潮湿也是诱导产气荚膜梭菌增殖的重要原因。富含蛋白质的鱼粉等高蛋白饲料是导致鸡坏死性肠炎加重的另一因素。高蛋白饲料通过改变肠道内微生物的组成、使肠道内pH升高、提供有害菌繁殖所需的营养而导致产气荚膜梭菌的大量增殖。

（3）各种因素导致的肠道菌群变化

在正常的肠道菌群中，肠道菌群通过调节鸡的免疫系统或竞争肠道营养而抑制产气荚膜梭菌的增殖，而在产气荚膜梭菌导致的坏死性肠炎肉鸡中，盲肠微生物群的产乳酸菌属、产丁酸菌属细菌和分段丝状细菌等益生菌明显减少。此外，菌群发生改变而导致黏膜免疫系统无法发挥其应有功能而导致无法抑制产气荚膜梭菌的增殖也是一种可能的原因。

02试验设计

Control：对照组，正常肉鸡；

NE：坏死性肠炎组，使用3×个巨型艾美耳球虫+5×CFU/mL产气荚膜梭菌建立模型；

NECB：坏死性肠炎肉鸡+丁酸梭菌组，将丁酸梭菌粉末加入肉鸡饲料中，其中丁酸梭菌粉末中菌含量为2×CFU/g，添加量为200-400g/吨饲料，添加时间为第1-22天。

03试验结果

1、差异基因统计：如图4-1C所示，样品间聚类的结果表明同一组中的不同样本之间（如Control1，Control2，Control3）差异基因基本一致，但不同组别之间（Control，NE，NECB）基因表达有明显的差异，表明坏死性肠炎的发生和饲喂丁酸梭菌对肉鸡肠道微生物有显著影响。

2、差异表达基因分析：GO分析显示NE和NECB两组的差异表达基因富集到生物过程（Biological Process，BP）中前十条包括白细胞激活、细胞活化、各种醇类合成、免疫系统调控、淋巴细胞活化、炎症反应等。KEGG分析显示NE和NECB的差异基因富集的主要KEGG通路有类固醇生物合成、细胞因子-细胞因子受体相互作用、氨基酸的生物合成、MAPK信号通路、ECM受体相互作用、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、黏着斑、细胞粘附分子、色氨酸代谢、p53信号通路等。这一结果表明丁酸梭菌可以通过调节坏死性肠炎肉鸡的肠道组织的基因表达来减轻肠道损伤和肠道炎症。

3、差异表达代谢物分析：PLS-DA分析显示，与坏死性肠炎肉鸡相比，饲料中加入丁酸梭菌使得肉鸡肠内容物代谢表型发生改变（图4-4A）。在正离子模式下，差异代谢物参与的主要代谢途径有14条，包括各种不饱和脂肪酸、脂肪酸、叶酸等生物合成过程，以及铁死亡、碳代谢、花生四烯酸代谢等代谢过程。并且在花生四烯酸通路中，前列腺素F2α、16(R)-HETE以及血栓素B2这三种致炎代谢物在NECB组中均极显著下降。在负离子模式下，差异代谢物富集到的KEGG代谢通路有28条，包括不饱和酸生物合成、脂肪酸代谢、生物合成与降解、MAPK信号通路、钙信号通路、程序性坏死等生物过程等（图4-4C）。这些代谢途径可能是丁酸梭菌发挥作用的潜在生物标志。

4、转录组与代谢组关联分析：在正离子模式下（图4-5A），共同富集到10条KEGG通路，包括花生四烯酸代谢、脂肪酸生物合成、铁死亡、碳代谢等。在负离子模式下（图4-5B），有21条KEGG通路被二者同时富集到，包括钙信号通路、铁死亡、嘧啶代谢、脂肪酸生物合成、程序性坏死、MAPK信号通路等。其中MAPK信号通路被广泛证明在多种生理过程中发挥重要作用，如细胞分化、应激、炎症等。已有文献报道益生菌可以影响MAPK信号通路而发挥作用。通过肠组织转录组和肠内容物代谢组的关联分析，确定了丁酸梭菌的代谢可能通过调控MAPK通路恢复坏死性肠炎肉鸡的肠道损伤。

04小结

本研究基于转录组学和代谢组学高通量测序方法，发现丁酸梭菌添加后显著改变了坏死性肠炎肉鸡肠组织基因表达和肠内容物代谢物的组成。通过转录组和代谢组的关联分析，推测丁酸梭菌可能通过影响MAPK通路发挥积极作用。这些基因的表达和代谢物可作为潜在的治疗靶点，为后续丁酸梭菌防治坏死性肠炎提供了新的证据。

参考文献：

许笑.丁酸梭菌改善坏死性肠炎患鸡肠黏膜屏障机制的初步研究[D].西北农林科技大学,2022.DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2022.001409.

金百合生物简介：

金百合生物成立于2013年，是一家专注于丁酸梭菌及其衍生物研发、生产、销售为一体的高新技术企业。公司多年来围绕着生物技术领域，致力于发酵微生态制剂的研发，依托农业部微生物产品质量监督检验测试中心、农业微生物学国家重点实验室等科研平台，搭建了高稳丁酸梭菌、功能性丁酸梭菌、丁酸梭菌培养物等技术研究应用推广平台。

金百合生物定位于“做最具价值的微生态”，提出了“设计有价值的模式、制造有价值的产品、提供有价值的服务”为全新的经营理念。以“让微生态为养殖提供价值”为指导思想，让微生态的价值看得见、算得出、摸得着。已荣获国家专精特新“小巨人”、国家高新技术企业、河南省制造业单项冠军企业、河南省“瞪羚”企业、河南省科技小巨人培育企业等荣誉称号。