摘要：问题：蛋白上样量太多，就像往膜上堆太多东西，后面信号和背景全混在一起，看都看不清。解决：要么减少上样量（比如原来加 50 微克，现在试试 30 微克），要么把抗体稀释得更稀（比如抗体浓度从 1:500 调到 1:1000）。这样信号和背景就能分开，目的条带也能
“各位做实验的小伙伴们，是不是每次跑 WB，背景一高就头大？别慌！今天咱就把 WB 背景高的问题拆开来，一步步解决，保证你听完就能上手调整。”
一、样品制备：蛋白上样别 “贪多”
问题：蛋白上样量太多，就像往膜上堆太多东西，后面信号和背景全混在一起，看都看不清。
解决：
要么减少上样量（比如原来加 50 微克，现在试试 30 微克），要么把抗体稀释得更稀（比如抗体浓度从 1:500 调到 1:1000）。这样信号和背景就能分开，目的条带也能清楚显示。
二、封闭步骤：给膜 “穿好防护衣”
问题：封闭没做好，要么时间短，要么封闭液选错了（比如封闭液和抗体打架，导致抗体乱黏），膜上的空白地方没被盖住，抗体就会非特异性结合，背景自然高。
解决：
延长封闭时间（原来 1 小时，现在试试 2 小时），或者增加封闭液里的蛋白浓度（比如 BSA 浓度从 5% 提到 10%），还可以换封闭液（比如用脱脂牛奶代替不合适的试剂）。总之，让膜上的空白全被封闭液盖住，抗体就不会乱黏了。
三、抗体杂交：浓度和温度要 “调对”
抗体浓度太高：抗体太浓，就像胶水涂多了，膜上到处黏糊糊，背景肯定高。解决：把抗体稀释得更稀（比如 1:2000 不行，就再稀到 1:3000），让抗体只和目标蛋白结合，别乱黏。孵育温度太高：室温孵育时，抗体太 “活跃”，容易和非目标蛋白结合。 解决：换成 4℃孵育（放冰箱里过夜），让抗体 “冷静” 下来，只找目标蛋白，减少非特异性结合。四、洗膜操作：“少量多次” 洗干净
问题：洗膜的时候偷懒，次数少、时间短，残留的抗体和杂质还在膜上，背景越洗越脏。
解决：
采用 “少量多次” 洗（比如每次用 10 毫升洗液，洗 5 次，每次 5 分钟，比用 20 毫升洗 3 次更干净）。还可以换更强的去垢剂（比如把 Tween-20 换成 NP-40），把膜上的杂质彻底冲掉。洗膜就像洗衣服，多洗几次，每次洗干净，膜自然清亮。
五、全程保湿：别让膜 “干巴巴”
问题：实验过程中膜干燥了，就会吸附杂质，背景直接 “爆掉”。
解决：
孵育、洗膜的时候，全程用湿盒（或者盖保鲜膜），让膜一直保持湿润。膜要是干了，背景肯定乱，所以随时检查，保持水润。
总结一下：控制上样量、做好封闭、调对抗体浓度和温度、洗膜彻底、全程保湿。这 5 步做到位，WB 背景高的问题基本就解决了。下次实验按照这个来，保证背景干干净净，目的条带清清楚楚。要是还有问题，找苏州阿尔法生物或评论区留言，咱一起讨论！现在就去试试这些方法，祝你实验顺利，结果漂亮！记得点赞收藏，下次实验不迷路～”
来源：王者荣耀真会玩