摘要：本研究围绕松弛素-3/RXFP3通路开展酒精使用障碍（AUD）治疗药物开发，基于首个RXFP3负变构调节剂（NAMs）RLX-33，设计合成了系列二苯基-1,2,4-恶二唑类似物。构效关系研究显示，RLX-33分子A位芳香环非RXFP3变构调节必需结构，B位吡
本研究围绕松弛素-3/RXFP3通路开展酒精使用障碍（AUD）治疗药物开发，基于首个RXFP3负变构调节剂（NAMs）RLX-33，设计合成了系列二苯基-1,2,4-恶二唑类似物。构效关系研究显示，RLX-33分子A位芳香环非RXFP3变构调节必需结构，B位吡咯烷酮连接基可替换为环状或直链烷基胺。优化得到的化合物(RR)-3相比RLX-33，效力提升且ADME性质（溶解性、代谢稳定性）改善，同时对RXFP1和RXFP4受体亚型具高选择性。动物实验证实，(RR)-3可显著抑制大鼠酒精自我给药行为，且不影响蔗糖自我给药及整体运动活性，表明RXFP3 NAMs作为AUD治疗候选药物的潜力。
药渡CyberSAR系统提供了对RXFP3受体变构调节剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。
研究背景
酒精使用障碍（AUD）是发达国家可预防性死亡的主要原因之一，美国2023年数据显示其影响约2890万12岁及以上人群。现有治疗药物（双硫仑、纳曲酮、阿坎酸）存在疗效不足、依从性低或副作用显著等问题，亟需基于新靶点的治疗药物。
松弛素-3/RXFP3通路在调控应激反应、奖赏动机等方面具有重要作用，其拮抗作用被视为AUD治疗新策略。临床前研究表明，RXFP3基因敲除小鼠应激后酒精偏好降低，RXFP3特异性拮抗剂R3(B1-22)R可抑制嗜酒大鼠的酒精自我给药及应激诱导复饮，且对蔗糖相关行为无影响。
研究团队开发了首个非肽类RXFP3负变构调节剂（NAMs）RLX-33，其在RXFP3过表达细胞中通过非竞争性机制抑制松弛素-3活性，对RXFP3选择性高于RXFP1和RXFP4。体内实验显示，RLX-33可阻断RXFP3激动剂诱导的摄食增加，显著减少雌雄大鼠酒精自我给药行为，且对运动活性、蔗糖自我给药及焦虑样行为无显著影响。该研究为AUD治疗提供了靶向RXFP3的新型候选药物及作用机制依据。
RLX-33作为研究RXFP3拮抗作用的工具化合物，存在效力较低（GTPγS IC50 = 3.02 μM）、水溶性差（R,R)-3，其效力和ADME性质（溶解性、代谢稳定性）优于RLX-33，且对RXFP1和RXFP4保持高选择性。动物实验表明，(R,R)-3腹腔注射可显著抑制大鼠酒精自我给药行为，且不影响蔗糖自我给药及运动活性。
结果与讨论
药物化学优化
研究以3-吡啶基化合物2为参考分子，针对RXFP3负变构调节开展结构优化。基于减少芳香环结构、引入成盐氨基基团及降低亲脂性的设计策略，对化合物2的A位和B位进行修饰以改善类药性质。通过[35S]GTPγS结合实验，利用CHO-hRXFP3细胞膜模型评估合成化合物对1 nM松弛素-3诱导的GTPγS结合抑制效力。实验结果显示，(R,R)-3在RXFP3受体结合实验中呈现剂量依赖性降低松弛素-3的Emax值，证实其负变构调节特性。
研究通过clogP和CNS-MPO评分预测化合物透血脑屏障能力，针对位点A开展构效关系研究：将化合物2的3-吡啶基替换为哌啶-3-基（化合物3）可使效力提升4倍（IC50 = 0.76 μM），亲脂性降至clog P = 3.5，芳香环数减少至3个，Fsp3增加，手性中心和哌啶环取代位置（2-位/4-位）对活性影响有限，(RR)-3（IC50 = 0.74 μM）、(SR)-3（IC50 = 0.78 μM）、化合物4（IC50 = 0.96 μM）和化合物5（IC50 = 0.71 μM）均保持较好活性；五元吡咯烷环取代的化合物6（clog P = 3.0）亲脂性降低但效力下降至IC50 = 1.70 μM；线性烷基胺修饰的仲胺化合物8（IC50 = 0.71 μM）与化合物3效力相当，且clog P = 3.0、CNS-MPO = 3.8，透血脑屏障潜力更优，而伯胺化合物9（IC50 = 1.45 μM）和叔胺化合物10（IC50 = 6.17 μM）活性显著降低，表明位点A的氢键供体对负变构调节活性至关重要。
研究针对B位开展构效关系研究：将化合物8的2-吡咯烷酮连接基替换为吡咯烷基（化合物11）或哌啶基（化合物12、13）后，IC50保持在0.9-1.5 μM，但亲脂性升高，且异构体间效力无显著差异；无连接基的化合物14（IC50 = 1.05 μM）虽效力略低于化合物8，但clog P
受体亚型选择性
研究选取(RR)-3、8、13和14（基于活性与结构多样性），通过RXFP3 cAMP积累实验验证拮抗效力并评估对RXFP1/RXFP4的选择性：(RR)-3对RXFP3的选择性显著高于RXFP1和RXFP4（>91倍），其cAMP IC50值与[35S]GTPγS结合实验结果一致；化合物8对RXFP1选择性优异，但对RXFP4选择性中等（31倍）。当8的吡咯烷酮基团被哌啶基替换（13）或去除（14）后，对RXFP4选择性分别下降至16倍和8倍，提示吡咯烷酮结构可能影响RXFP3/RXFP4选择性，而13和14对RXFP1仍保持较好选择性。RXFP3与RXFP4的序列一致性为43%、相似性60%，而RXFP1具有独特的大细胞外结构域，这解释了化合物对RXFP1选择性更优的原因。所有化合物在30 μM浓度下对RXFP1/RXFP4均无激动活性。
体外ADME性质
研究选取(R,R)-3（基于效力和选择性）进行体外ADME分析，以RLX-33为对照：与RLX-33相比，(RR)-3因亲脂性降低（clog P = 3.5 vs. 4.1），溶解性和血浆蛋白结合率（PPB）改善；其在MDCK-MDR1实验中显示适度血脑屏障通透性（Papp = 1.1×10-6 cm/s，外排比率2.8）；在大鼠肝微粒体中代谢稳定性显著提升（t1/2 = 205 min，CL = 6.8 μL/min/mg vs. RLX-33的t1/2 = 11 min，CL = 132 μL/min/mg）。
(R,R)-3的体内药代动力学特征
本研究对(RR)-3进行体内药代动力学（PK）分析，以指导剂量设计及后续优化，并考察性别影响：雄性大鼠腹腔注射10 mg/kg后，血浆Cmax为2121 ng/mL（30 min达峰），血浆代谢稳定性优异（t1/2 = 12小时，CL = 18 mL/min/kg），脑内Cmax为185 ng/mL（1 h达峰），24小时浓度维持恒定，脑/血浆AUC比率（Kp）为0.44，显示中等脑穿透性，与体外实验一致；雌雄大鼠PK参数无显著差异，不同于前期RLX-33在性别有效性上的差异。
(R,R)-3的体内活性
本研究评估(RR)-3对酒精自我给药行为的体内抑制作用：利用雌雄Wistar大鼠建立酒精（15%, v/v）自我给药模型，腹腔注射溶媒或(RR)-3（5-20 mg/kg）后发现，雄性大鼠中15和20 mg/kg剂量可显著减少酒精自我给药行为，雌性大鼠仅20 mg/kg剂量有效，且行为学效应与酒精摄入量降低一致。药代动力学数据显示，10 mg/kg剂量的脑内Cmax为157-185 ng/mL（0.3-0.4 μM），20 mg/kg剂量估计脑内Cmax为0.6-0.8 μM，接近其GTPγS结合实验IC50值（0.74 μM），提示(RR)-3对RXFP3的部分阻断即可在体内产生抑制酒精摄入的效果。
研究评估(RR)-3对天然奖赏（蔗糖）自我给药行为及非特异性行为的影响：在蔗糖（0.5%, w/v）自我给药模型中，(RR)-3各剂量（5-20 mg/kg）均不影响雌雄大鼠的蔗糖自我给药行为（图4B），表明其对酒精强化行为的选择性作用；在开放场实验中，20 mg/kg剂量的(RR)-3不影响大鼠移动距离（图5A）及中心区域停留时间（图5B），提示其对一般运动活性和焦虑样行为无影响。
总结
神经肽松弛素-3通过同源受体RXFP3调控应激反应与奖赏动机，其拮抗作用是治疗酒精使用障碍（AUD）的新策略。负变构调节剂（NAMs）作用于非正构结合域，较正构拮抗剂具有更高亚型选择性（如RLX-33对RXFP3选择性超RXFP1/4）和安全性，且克服了正构肽类需中枢给药的局限（RXFP3与RXFP4正构口袋序列一致性86.4%）。本研究基于RLX-33骨架设计新型二苯基-1,2,4-恶二唑类化合物，通过构效关系优化发现(RR)-3：其RXFP3拮抗效力（GTPγS IC50 = 0.74 μM）较RLX-33提升约4倍，大鼠肝微粒体代谢稳定性（t1/2 = 205 min）增强近20倍，对RXFP1/4选择性超91倍；腹腔注射可剂量依赖性抑制雌雄大鼠酒精自我给药行为（雄性15-20 mg/kg、雌性20 mg/kg有效），脑内浓度与受体亲和力匹配（20 mg/kg时Cmax约0.6-0.8 μM），且不影响蔗糖奖赏、运动及焦虑相关行为，血脑屏障通透性适中（Kp = 0.44）。该化合物为AUD治疗提供了新型候选分子，后续将优化其脑穿透性并开展脱靶效应及更多模型验证。
文献来源
10.1021/acs.jmedchem.5c00361
来源：药渡数据库