摘要：在我们每个细胞深处，都存在着成百上千个微小的“动力工厂”——线粒体 (Mitochondria)。它们拥有自己独立的遗传密码（mtDNA），但这份密码本却异常脆弱，一旦出错，便会引发一系列毁灭性的遗传疾病，如导致青年人迅速失明的Leber遗传性视神经病变 (L

在我们每个细胞深处，都存在着成百上千个微小的“动力工厂”——线粒体 (Mitochondria)。它们拥有自己独立的遗传密码（mtDNA），但这份密码本却异常脆弱，一旦出错，便会引发一系列毁灭性的遗传疾病，如导致青年人迅速失明的Leber遗传性视神经病变 (LHON)。然而，修复这份深藏于“细胞堡垒”内的密码，一直是现代医学难以逾越的鸿沟，即便是大名鼎鼎的CRISPR基因魔剪也束手无策。

研究人员曾开发出能潜入线粒体的碱基编辑器 (Base Editor)，就像一支能修改单个DNA字母的铅笔，为治愈带来了曙光。但初代的“铅笔”笔尖太钝，编辑效率低下，远不足以逆转疾病或构建精确的疾病模型。

现在，这一困局迎来了历史性的突破！近日一项发表于《Nature Biotechnology》的重磅研究“Efficient mitochondrial A-to-G base editors for the generation of mitochondrial disease models”，通过蛋白质工程，成功锻造出了一款堪称“史上最强”的线粒体A-to-G碱基编辑器（eTd-mtABEs）。它不仅将编辑效率提升至前所未有的87%，比初代工具高出145倍，更解决了致命的脱靶风险，实现了前所未有的精准与安全。

更令人振奋的是，研究团队利用这把“神兵利器”，成功在大鼠胚胎中引入了致病突变，创造出世界上首个由A-to-G碱基编辑技术构建的、具有感音神经性听力损失表型的线粒体疾病动物模型。这不仅是基础研究的里程碑，更意味着我们终于掌握了一把足够锋利的钥匙，有望打开治愈线粒体遗传魔咒的大门。

“基因魔剪”的禁区：为何编辑线粒体DNA如此之难？

近年来，CRISPR-Cas9技术如雷贯耳，它像一把可编程的“基因魔剪”，能够在细胞核DNA的汪洋大海中实现“指哪打哪”的精准切割。然而，这把神兵利器却对线粒体束手无策。线粒体被两层膜包裹，像一座固若金汤的城堡，绝大多数蛋白质，包括Cas9蛋白和它的向导RNA，都无法进入。

为了攻克这道难关，研究人员另辟蹊径，开发了不依赖于CRISPR的碱基编辑器 (Base Editor, BE)。想象一下，如果说CRISPR是“剪切-粘贴”，那么碱基编辑就是用“橡皮擦-铅笔”，直接在DNA序列上修改单个碱基，比如将A改为G，或将C改为T，损伤更小，也更适合修复由单个碱基错误（即点突变 (point mutations)）引起的疾病。据统计，在已知的致病性mtDNA突变中，高达95%都是点突变！

基于这个思路，研究人员将能够识别特定DNA序列的TALE蛋白 (Transcription activator-like effector)与一种名为DddA的细菌脱氨酶 (deaminase)结合，创造出了第一代线粒体胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs），实现了C到T的编辑。随后，通过将TALE蛋白与进化的腺嘌呤脱氨酶 (adenine deaminase, AD)——TadA的变体相结合，又开发出了线-粒体腺嘌呤碱基编辑器（mtABEs，也称TALEDs），能够实现A到G的编辑。这两种工具的诞生，意味着我们理论上可以纠正绝大多数mtDNA点突变。

然而，理想很丰满，现实却很骨感。早期的mtABEs虽然开创了新纪元，但存在一个致命的弱点——编辑效率太低。线粒体疾病有一个关键特征叫做异质性 (heteroplasmy)，即细胞内同时存在野生型和突变型的mtDNA。通常，只有当突变mtDNA的比例超过一个很高的阈值（通常>50%）时，疾病才会表现出来。因此，一个有效的治疗工具，必须能够将突变比例降到足够低，或者在构建疾病模型时，将突变比例提升到足够高。而初代工具那“不温不火”的效率，显然难以担当此重任。

挑战已经明确：我们需要的不是一把普通的“铅笔”，而是一支笔尖锋利、下笔精准、一气呵成的“超级画笔”！ 这正是该研究的出发点和核心任务。

百炼成钢——在细胞核中打造“超级脱氨酶”

研究团队深知，整个mtABE系统的核心引擎，就是那颗负责执行A到G转换的TadA脱氨酶。要想提升整体性能，必先从强化这个引擎开始。他们采用了一种强大的技术——定向进化 (directed evolution)，对当时性能最优的TadA-8e蛋白进行了一场“魔鬼训练”。

他们首先将战场设定在更容易操作的细胞核 (nucleus)中，构建了一个基于CRISPR的腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e）系统作为“训练场”。他们基于TadA-8e蛋白的晶体结构，锁定了16个位于或邻近活性口袋的关键氨基酸 (amino acid)残基，然后对它们进行了系统性的突变，创造出了51个新的TadA变体。

接下来，就是一场残酷的“大逃杀”式的筛选。研究人员在人类HEK293T细胞的两个基因组位点（HEK site 7 和 PTEN-sg2）上，测试了所有这些新变体的编辑能力。这两个位点都包含多个呈“TA*”或“CA*”形式的腺嘌呤（A），这是TadA-8e比较偏爱的编辑模式。

很快，几位“天选之子”在激烈的竞争中脱颖而出。数据显示，原始的ABE8e在HEK site 7的A3位置编辑效率为31.4%，而在A9和A10这两个“非传统”编辑窗口，效率只有8.2%和8.9%。然而，几个新变体表现出了惊人的潜力：

A142W突变体：在A3位置的效率提升至49.7%，而在A9和A10位置，效率分别飙升至32.9%和14.7%！

A142R突变体：同样表现出色，在A3、A9和A10位置的效率分别达到了43.1%、20.9%和12.5%。

L145W突变体：这是一个“广谱高手”，它在A9和A10位置的编辑效率达到了惊人的40.3%和26.0%，相比原始版本提升了数倍之多！

更重要的是，这些新变体不仅提升了效率，还极大地拓宽了编辑窗口和序列偏好性。TadA-8e原本对“YA*”（Y代表C或T）序列情有独钟，而对“RA*”（R代表A或G）序列则“兴致缺缺”。然而，经过对29个内源性基因位点的广泛测试，研究人员发现，这些新变体，特别是A142W和由A142R/L145W组合而成的RW突变体，在所有序列背景下（TA, CA, GA, AA）的活性都得到了显著增强。尤其是在原本最困难的“GA”和“AA”序列上，它们的编辑效率平均提升了4.0到4.5倍！

这意味着，这把“铅笔”的笔尖不仅变得更锋利，而且不再“挑纸”，几乎可以在任何类型的“纸张”（DNA序列）上流畅书写。至此，一个性能超凡的“超级脱氨酶”核心诞生了。现在，是时候把它请出“训练场”，送往它真正的战场——线粒体了。

利刃出鞘——eTd-mtABEs的效率革命

研究人员将这些经过千锤百炼的TadA新变体，与TALE蛋白和线粒体靶向序列（MTS）融合，构建出了一系列全新的线粒体腺嘌呤碱基编辑器，并将其命名为eTd-mtABEs（engineered TadA-derived mitochondrial ABEs）。

它们与前辈，基于原始TadA的sTALED，的对决，结果是压倒性的。

在一个靶向人类mtDNA中ND5基因的位点，sTALED的编辑效率在6.5%到29%之间徘徊。而eTd-mtABE-A142W一出手，效率直接跃升至14%到71%的区间！这意味着在某些碱基位点，效率提升了数倍甚至一个数量级。

在另一个靶向ND1基因的位点，sTALED的表现更差，平均效率仅为7%。而搭载了RW突变体的eTd-mtABE，平均效率达到了26%，如果将编辑器换到另一个TALE臂上，效率更是高达66%！

最令人振奋的数据来自一个靶向ND4基因的位ט点，这里的A-to-G编辑效率最高达到了惊人的87%！这是一个前所未有的数字，它已经远远超过了大多数线粒体疾病发病所需的突变阈值，标志着我们终于拥有了足以在细胞层面高效诱导或逆转线粒体病理状态的强大工具。

研究团队还测试了这些编辑器在大鼠细胞中的表现。结果显示，eTd-mtABEs的编辑效率比传统的TALEDs高出145倍！这种跨物种的超高活性，证明了其强大的普适性和应用潜力。

这场效率革命的意义是深远的。它意味着研究人员在构建线粒体疾病细胞或动物模型时，不再需要“听天由命”，而是可以稳定、高效地引入致病突变，从而更深入地研究疾病机理、筛选药物。对于未来治疗，它也让人们看到了通过一次性编辑，就可能将致病mtDNA比例永久性地压制在安全线以下的曙光。

精准与安全——“脱靶效应”的终极考验

一把威力巨大的武器，如果不能精准控制，就可能造成灾难性的后果。对于基因编辑器而言，最大的风险就是脱靶效应 (off-target effect)——即在非目标位点进行错误的编辑。

研究团队对此进行了极为严苛的“安检”。

DNA脱靶：安全可控

他们首先利用线粒体全基因组测序 (mitochondrial WGS)，检查了eTd-mtABEs是否会在mtDNA的其他区域“惹是生非”。结果显示，相比于sTALED，eTd-mtABEs的线粒体DNA脱靶水平确实有轻微增加，但总体仍处于非常低的背景水平，且没有表现出特定的序列偏好性。这就像一支强力画笔在画画时，偶尔会掉落一两个微小的墨点，但完全不影响主画面的清晰度。

RNA脱靶：重大突破

一个更隐蔽的风险是RNA脱靶。此前的研究发现，TadA脱氨酶不仅能编辑DNA，还能编辑RNA，这可能导致细胞内大量蛋白质功能紊乱。研究团队选取了4个已知的RNA高频脱靶位点进行检测。结果令人惊喜：原始的TALEDs在这些位点造成了9%到41%的RNA编辑，这是一个相当高的风险。然而，研究人员发现，他们新开发的两个组合突变体——RW/V28A和RW/V106W——几乎完全消除了RNA脱靶活性！它们在保持高DNA编辑效率的同时，展现出了超凡的“洁癖”，只专注于DNA，对RNA“视而不见”。这无疑是向临床应用迈出的关键一步。

链偏好性编辑：追求极致精准

在线粒体编辑中，有时我们只想修改DNA双链中的一条链，以避免另一条链上可能存在的“旁观者”碱基被误伤。研究人员曾开发过一种名为miABEMuth的工具，它用一个切口酶 (nickase)取代了DddA蛋白，实现了只编辑“未被切开”那条链的链偏好性编辑 (strand-preferred editing)。但同样，它的效率也不尽如人意。

研究团队将他们新进化的TadA变体，如RW，植入了miABEMuth的框架中。奇迹再次发生。在三个不同的测试位点，新工具的A-to-G编辑效率平均提升了3.2倍！例如，在RNR2基因的一个位点，编辑效率从原来的7%跃升至25%；在ND1基因位点，更是从22%飙升至44%。这表明，他们的“超级脱氨酶”具有极强的兼容性，可以赋能各种不同架构的编辑器，将精准编辑的效率和实用性提升到了新的高度。

经过这一系列严苛的考验，eTd-mtABEs证明了自己不仅是“大力士”，更是一位“精雕细琢的艺术家”，在效率、精准度和安全性上取得了完美的平衡。

巅峰对决：活体动物模型中的惊人表现

所有的细胞实验，最终都要走向活体，才能证明其真正的价值。研究团队发起了最终的挑战：利用eTd-mtABEs，在活体动物体内创建线粒体疾病模型。

在人类细胞中模拟致病突变

他们首先将目标锁定在与LHON和Leigh综合征相关的两个ND6基因突变上：m.14484T>C和m.14487T>C。在人类细胞中，传统的sTALEDs对这两个位点的编辑效率分别低于15%和3.8%，难以有效模拟疾病。

而eTd-mtABEs，尤其是eTd1-mtABE-RW和精准版eTd1-mtABE-RW/V28A，能够以高达41-48%的效率，同时或单独地引入这两个致病突变。更重要的是，成功引入突变的细胞表现出了典型的病理特征：细胞内活性氧 (ROS)水平显著升高，而能量货币ATP的水平则显著下降。这完美地在细胞层面复现了线粒体功能障碍的真实状态。

在大鼠体内创造“听障”模型

最激动人心的实验，是在大鼠身上进行的。人类TRNS1基因上的两个点突变（m.7510T>C 和 m.7511T>C）会导致感音神经性听力损失 (SNHL)。研究团队设计了能够在大鼠体内相应位点（m.6929T>C 和 m.6930T>C）引入突变的eTd-mtABE-RW编辑器。

他们将编码该编辑器的mRNA直接注射到大鼠的受精卵 (zygote)中。结果堪称完美：

100%的成功率：所有出生的F0代大鼠（共54只）都成功携带了目标突变！

超高的编辑效率：在这些新生大鼠体内，T9和T10两个位点的平均编辑效率都达到了27%，最高的一只个体甚至达到了44%！

成功的疾病模拟：研究人员对这些F0代大鼠进行了听觉脑干反应 (ABR)测试。结果显示，与野生型大鼠相比，这些携带突变的大鼠在3 kHz和20 kHz频率下的听阈显著升高，清晰地表明它们出现了听力障碍。

这是首次利用A-to-G线粒体碱基编辑器，在活体动物中成功创建出具有明确表型的遗传性疾病模型。 这项成就的意义，不仅仅是制造了一只“听不见”的老鼠，它雄辩地证明了eTd-mtABEs这把“手术刀”的威力，已经足以在复杂的生命体内，完成改写生命密码的精密操作。

一扇通往未来的大门

回到我们最初的问题：我们能否破解线粒体疾病的遗传魔咒？这项发表在《自然·生物技术》上的研究，给出了一个响亮而肯定的回答。

通过对TadA脱氨酶的深度改造，研究团队创造了一套高效、精准、安全且通用的线粒体腺嘌呤碱基编辑工具——eTd-mtABEs。它们：

效率超群：在人类细胞中最高实现87%的编辑，在大鼠模型中效率提升145倍，足以跨越疾病的“异质性”门槛。

靶点广泛：打破了传统编辑器的序列限制，几乎可以在任何序列背景下高效工作。

安全可靠：通过精巧的蛋白质工程，极大地降低了致命的RNA脱靶风险，同时将DNA脱靶控制在极低水平。

功能强大：成功用于创建细胞和动物水平的线粒体疾病模型，并首次在活体动物中展现出明确的疾病表型。

这扇由eTd-mtABEs开启的大门，通向一个充满无限可能的未来。对于基础研究，研究人员终于有了一把“顺手”的工具，可以随心所欲地构建各种复杂的线粒体疾病模型，去探索那些困扰我们已久的生命之谜。而对于临床医学，尽管从实验室到病床仍有很长的路要走，但这项技术无疑是迄今为止，我们距离“治愈”线粒体疾病最近的一次。

它让我们有理由相信，在不远的将来，那些因线粒体缺陷而生活在黑暗与痛苦中的患者，或许真的能够通过一次精准的“基因修复”，重获光明与健康。

参考文献

Chen L, Hong M, Luan C, Yuan M, Wang Y, Guo X, Fang Y, Huang H, Dong X, Gao H, Zhang D, Chen X, Meng D, Huang M, Yi Z, Liu M, Wei W, Gao L, Song G, Zhou X, Li D. Efficient mitochondrial A-to-G base editors for the generation of mitochondrial disease models. Nat Biotechnol. 2025 Jun 3. doi: 10.1038/s41587-025-02685-x. Epub ahead of print. PMID: 40461783.

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来源：生物探索一点号1