摘要：通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善，低至5ng的DNA量也能被建库成功；少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求，通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子，最终能够捕获的DNA量会很低。

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以下是关于本次直播的一些常见问答，一起来看下吧~

常见问答

1.ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量？

通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善，低至5ng的DNA量也能被建库成功；少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求，通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子，最终能够捕获的DNA量会很低。

2.ChIP实验如何设置对照及重复？

通常ChIP过程产生3份DNA产物，Input、IgG产物、IP产物。Input是染色质片段化后提取获得的总DNA、未经抗体加入免疫沉淀过程，IgG组这是用实验抗体的同型阴性对照抗体、作为mock IP，IP产物即是以实验抗体获得的免疫沉淀产物。

在后续的qPCR检测中，通常将IgG产物组作为IP产物组的对照。如需设置阳性对照抗体，可以选择Histone H3或者RNA polymerase II，然后以GAPDH或Actin等作为检测基因。

在后续的Sequence中，通常将Input组产物作为测序对照样品。

3.抗体的需要用量是多少？需要准备多少抗体？

在ChIP实验中，一个免疫沉淀反应使用5μg左右的抗体量，具体用量需要通过摸索调试，若效价不佳可能需增加到10μg左右，因此做一个样本需要准备的抗体量至少应＞10μg或10μL。

4.ChIP实验植物样本处理和动物组织/细胞有何区别？

植物组织由于细胞壁、气腔等结构的存在，会给交联缓冲液的作用带来困难，因此相对于动物组织/细胞来说，往往需要在抽真空条件下进行交联，而该步骤是一个需要经验及优化的过程。

5.丝状真菌TF的怎么准备样品？提供新鲜培养的菌丝可以吗？需要特殊化合物诱导收样吗？可以N端也加flag吗？

a.新鲜培养的菌丝可以作为ChIP实验的样品，但需要确保菌丝的活性和状态良好。如果菌丝在培养过程中受到污染、生长异常或处于特殊生理状态，可能会影响实验结果。新鲜菌丝收集后应尽快进行后续处理，如固定等，以避免细胞死亡或转录因子活性变化。如果不能及时处理，可将菌丝在液氮中速冻，然后置于-80℃长期保存。

b. 是否需要特殊化合物诱导收样取决于研究目的和转录因子的特性。如果要研究特定环境因素或信号通路对转录因子与DNA结合的影响，可能需要使用相应的诱导剂。例如，某些激素、药物或环境刺激物可以诱导转录因子的表达或激活其活性，从而使其与特定的DNA序列结合。

c.N端加Flag标签是可行且常用的策略，但必须验证证融合蛋白的表达和功能是否正常，以及flag抗体的特异性和亲和力是否满足ChIP实验的要求。

6.稻叶片做chip seq，用HA 标签抗体，成功率高吗？

用HA标签抗体在稻叶片上做ChIP-seq的成功率受多种因素影响，不能简单地给出一个确定的高低结论：

如果目标蛋白与HA标签的融合表达效果良好，且HA标签能够稳定地暴露在蛋白表面，那么HA标签抗体就有可能较好地识别目标蛋白，从而提高ChIP-seq的成功率。从样本层面来说，水稻叶片细胞含有细胞壁等复杂结构，这可能会增加交联和染色质提取的难度，影响蛋白质-DNA复合物的完整性和可及性。而且ChIP-seq实验涉及多个步骤，任何一个步骤的操作失误都可能影响实验结果。

来源：金开瑞生物