Cancer Cell丨基于质谱流式成像技术的乳腺癌分型系统

摘要：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）具有侵袭性强、发病早、转移潜能高且复发率高的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌病例的10%–15%。TNBC涵盖多种组织学亚型，预后范围较为广泛【1】。分子分型研究表明，TN

撰文 | 楚雨荨

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）具有侵袭性强、发病早、转移潜能高且复发率高的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌病例的10%–15%。TNBC涵盖多种组织学亚型，预后范围较为广泛【1】。分子分型研究表明，TNBC与基底样乳腺癌（ basal-like breast cancer ）存在高度重叠（约80%），同时也和健康乳腺上皮中的管腔前体细胞共享部分分子特征【2，3】。在TNBC中，早期研究已将一种同时表达基底（basal）和管腔（luminal）角蛋白（keratins）的基底-管腔前体细胞，并将其与肿瘤发生能力的增强联系起来【4】。然而，该类型细胞比例较低并且TNBC患者肿瘤内部个体差异显著。 TNBC肿瘤内部的异质性是临床管理的主要障碍，由于TNBC患者在乳腺癌队列研究中的代表性不足，基于整体分型的早期尝试未能显著改善TNBC的临床分类和治疗效果。

近日，来自瑞士苏黎世大学定量生物医学系 Bernd Bodenmiller 团队在 Cancer Cell 杂志上发表了文章 A stratification system for breast cancer based on basoluminal tumor cells and spatial tumor architecture ，利用质谱流式成像技术（imaging mass cytometry，IMC）对TNBC患者的肿瘤组织芯片（TMA）进行39重标记染色的单细胞解析，并整合乳腺癌分子亚型的多组学数据进行分析鉴定出：（1）11种TNBC肿瘤细胞表型，其中包括与快速复发相关的干细胞样基底-管腔型肿瘤表型；（2）基于单个肿瘤细胞角蛋白表达水平和CD8 T细胞-肿瘤细胞互作模式，划分出5种具有不同预后的乳腺癌亚型。

质谱流式成像技术（imaging mass cytometry，IMC）利用重金属同位素标记抗体，将免疫组织化学技术的（immunohistochemistry，IHC）与质谱流式细胞技术（CyTOF）相结合，能够在亚细胞分辨率水平上对组织样本进行原位分析，同时检测50余种靶标分子的丰度变化及其空间分布。已有研究团队利用IMC技术高分辨率描绘肺腺癌空间免疫微环境图谱（详见Bioart报道：）。为更好地理解和预测TNBC的临床结局，需要对肿瘤细胞表型异质性及其与微环境中其他细胞的空间相互作用进行精准描绘。

研究团队利用质谱流式成像技术对215例TNBC患者术后肿瘤组织芯片（tumor microarray，TMA）进行39重组织原位抗体染色，染色方案涵盖基底/管腔细胞角蛋白（ cytokeratins ， CK) 标记、肿瘤相关信号通路、通用免疫细胞表面标志物和抗原递呈等相关标记的检测，在单细胞层面对肿瘤表型和微环境进行解析。

在探究肿瘤细胞表型方面，基于肿瘤特异性标志物鉴定出60个肿瘤细胞簇（clusters），基于表面标志物的平均表达水平聚类分析，进一步归纳出11个肿瘤细胞元簇（metaclusters，MC）。在不同TNBC对列中验证MC分类的准确性发现，该分类下多种肿瘤细胞表型以及独特亚群基底-管腔混合型肿瘤MC8（CK5+/CK7+）和MC7（HLADR+）在不同队列中均存在。

那么，该分类下的肿瘤细胞表型是否具有预后意义呢？在与临床特征的相关性分析中，该分类标准下肿瘤中MC的表达特征与患者生存结局以及淋巴结转移密切相关。有意思的是， CK5+/CK7+ 基底-管腔混合型肿瘤MC8比例较高的患者具有更高的无疾病生存（DFS）风险，并且根据CK5、CK7在单个肿瘤细胞的表达情况进行4类分型： CK5+/CK7+、CK5 + 、CK7+和CK5 − /CK7 − ，并在多个队列中验证CK5+/CK7+表型为主的患者 DFS 显著降低。约三分之一的TNBC患者（71/215）存在MC8，其中有8%（18例）至少由10个CK5+/CK7+肿瘤细胞组成“斑块”，并且TMA样本能够反映肿瘤组织整体情况（相关性分析 Spearman = 0.75， p = 0.0074）。结合 TCGA BRCA队列和接受新辅助化疗的MDACC乳腺癌队列的批量表达数据，说明 CK5+/CK7+基底-管腔混合型肿瘤细胞在TNBC中普遍存在，其丰度为TNBC患者的快速疾病复发提供了独立的预后信息。

结合不同队列转录组数据和乳腺癌患者类器官单细胞测序数据分析发现 KRT5+/KRT7+ （编码CK5、CK7）细胞不仅上调分化相关基因集，还高表达干/ 前体细胞特征基因及管腔前体细胞以及基底-管腔基因特征，提示其具有高度可塑性。通过18重免疫荧光对 TNBC 肿瘤组织全切片染色在蛋白水平上验证了 CK5+/CK7+肿瘤细胞显著高表达ALDH1A3、SOX9等关键干/ 前体细胞相关蛋白和基底状态标志物 H3K27Ac。

IMC在队列中的非上皮细胞区域中鉴定出21个肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment，TME）表型和进一步聚类为9类MC 。值得注意的是，Cox回归多因素分析结果表明TME表型未能在肿瘤表型指征预后的基础上提供更多的增益，提示肿瘤表型对生存结局的影响更为关键。基于CD8 T细胞与肿瘤细胞的空间分布特征，将患者分为3组：炎症型（Inflamed）、排斥型（Excluded）和冷肿瘤型（Cold），相较于炎症型，排斥型和冷肿瘤型患者具有更低的无疾病生存和疾病复发风险。“炎症型”患者肿瘤细胞有更高的HLA-DR表达，并且超半数患者PD-L1阳性（其他类型患者PD-L1均为阴性），若仅仅依赖CD8 T细胞数量的肿瘤分型无法预测免疫治疗响应率，进一步凸显空间信息的重要性。

最后，基于上述CD8 T-肿瘤互作的TNBC分型，研究者们提出了5种更简易、贴近临床并具有独特肿瘤表型和TME的分型方案，除炎症型INF（Inflamed）患者外，将排斥型和冷肿瘤型患者进一步按照肿瘤CK5和CK7的表达水平分为BL ( Basoluminal ，CK5+/CK7+为主)、B（ Basal ，CK5+为主）、L (L uminal ，CK7+为主) 和N型 (Not b as al/ Not luminal ，CK5-/CK7-为主)，该分型下患者的疾病复发风险差异显著，可进一步简化为高（BL）、中（B/L/N）、低（INF）风险组。与现有TNBC分型（ TNBCtype、TNBCtype-4 ）相比该TNBC分型在 TCGA和MDACC 队列中与 DFS/PFS/DRFS (无进展生存，PFS; 无远处复发生存，DRFS) 显著相关，联合多个队列分析发现，INF组对新辅助治疗有最佳的响应，而BL高风险组肿瘤具有干细胞样特征，在机制上可能通过巨噬细胞浸润、缺少与肿瘤互作的CD8+ T细胞以及免疫抑制检查点上调等介导免疫逃逸。

综上，这项研究基于质谱流式成像技术构建三阴性乳腺癌组织原位的单细胞图谱，精准描绘TNBC中的肿瘤和免疫微环境表型，发现一种具有预后意义的干细胞样基底-管腔上皮肿瘤细胞的TNBC表型,结合单个肿瘤细胞表型和CD8+T细胞-肿瘤细胞互作模式，实现了跨队列的临床肿瘤分型。

制版人：十一

参考文献

1. Nolan, E., Lindeman, G.J., and Visvader, J.E. (2023). Deciphering breast cancer: from biology to the clinic. Cell 186, 1708–1728. https://doi.org/ 10.1016/j.cell.2023.01.040. 2.

2 . Prat, A., and Perou, C.M. (2011). Deconstructing the molecular portraits of breast cancer. Mol. Oncol. 5, 5–23. https://doi.org/10.1016/j.molonc. 2010.11.003. 3.

3 . Gray, G.K., Li, C.M.C., Rosenbluth, J.M., Selfors, L.M., Girnius, N., Lin, J. R., Schackmann, R.C.J., Goh, W.L., Moore, K., Shapiro, H.K., et al. (2022). A human breast atlas integrating single-cell proteomics and transcriptomics. Dev. Cell 57, 1400–1420.e7. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2022. 05.003.

4 . Jarasch, E.-D., Nagle, R.B., Kaufmann, M., Maurer, C., and Bocker, W.J. (1988). Differential diagnosis of benign epithelial proliferations and carci- nomas of the breast using antibodies to cytokeratins. Hum. Pathol. 19, 276–289. https://doi.org/10.1016/S0046-8177(88)80520-3.

学术合作组织