摘要：肺内皮细胞（LuEC）在肺再生和支持肺类器官（LO）中发挥着重要的作用。然而，尚未报道使用LuEC进行LO培养的详细指南。

美国得克萨斯大学MD安德森癌症中心Bongjun Kim和Jae-Il Park团队2025年6月在Star Protocols（IF=1.4）发表了一篇技术文章“Protocol for establishing genetically engineered murine lung organoids mimicking cell plasticity and regeneration”。

文章介绍

题目：建立模拟细胞可塑性和再生的基因工程小鼠肺类器官的方案

期刊：Star Protocols

影响因子：1.4

发表日期：2025年6月

#1

摘要

Abstract

肺内皮细胞（LuEC）在肺再生和支持肺类器官（LO）中发挥着重要的作用。然而，尚未报道使用LuEC进行LO培养的详细指南。

美国MD安德森癌症中心Bongjun Kim和Jae-Il Park提出了一种用于产生和培养模拟再生的小鼠LO的有效方案。还描述了分离LuEC和肺上皮细胞，然后进行LO培养的步骤；以及如何使用病毒转导建立基因工程LO。

实验设计

首先分离并培养成熟肺内皮细胞，再在气-液界面中用LuEC培养LO，然后进行类器官传代和慢病毒培养，最后进行慢病毒转导。

预期结果

该研究使用具有LuEC的广泛肺上皮细胞，使用最小的外部刺激来培养模拟再生的肺类器官。观察到LO产生了所有的肺结构(肺泡、细支气管和细支气管肺泡)。

局限性

该方案模拟再生使用LuEC作为饲养细胞。但生理状态下不仅含有内皮细胞，还包括各种其他类型的细胞，如免疫细胞和间充质细胞。因此，需要使用多种细胞（包括免疫细胞和间充质细胞）进一步优化LO，以精确地重现再生。

该方案针对C57BL/6小鼠源性LO实验进行了优化。所有的时间线和尺度在C57BL/6中得到了验证，但在其他物种或菌株中没有得到验证。因此，需要进一步的测试来将该方案应用于不同的菌株或物种。

实验步骤

成熟肺内皮细胞的分离和培养

Day1：4h

1.制备冰、冰冷的氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液和冰冷的磁活化细胞分选（MACS）缓冲液。在37℃下制备LuEC生长培养基。

2.在分离LuEC之前，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备0.2%明胶溶液，通过0.2 μm过滤器过滤，并在37℃下储存。

3.制备肺解离缓冲液，并置于37℃。

4.将2-3周龄的小鼠用CO2吸入法处死，然后进行颈椎脱臼。

5.切下肺叶，并将其转移至含3%青霉素-链霉素的冷Leibovitz’s L-15培养基中。

a.用剪刀打开小鼠胸腔。首先切开老鼠的皮肤，然后切开胸骨打开胸腔。

b.在切除肺以去除肺中的免疫细胞和红细胞（RBC）之前，使用22 G针头的注射器将PBS缓慢冲洗到右心室中，直到肺变白色。通常，每只小鼠使用5-10 mL PBS。

c.用剪刀剪下每个肺叶，转移至Leibovitz’s L-15培养基中。

注：切割靠近肺叶的每个肺叶，以尽量减少收集气管、食管和额外结缔组织。

注：肺叶可在冰上保存长达1 h，以将肺叶转移至组织处理室。

6.将组织置于冰上的10 cm Petri培养皿中进行处理。

a.如果存在剩余的食管、气管和额外的结缔组织，则使用镊子将其取出。

b.用手术刀片或手术剪将组织切成1 mm3块。

c.将切碎的组织收集到2 mL Eppendorf管（或15 mL锥形管）中。

7.在37℃下，用1.7 mL肺解离缓冲液解离肺30 min。

a.消化10分钟后，用1 mL移液器吸头吸取组织，直至所有碎片均通过吸头。当所有碎片都能通过吸头时，停止移液。

注：肺解离时间最长可增加至45分钟。

注：当处理两个以上肺样本时，每个肺使用含1.7 mL肺解离缓冲液的试管。

8.加入300 μL FBS停止消化，然后移液

9.使用ACK裂解缓冲液进行RBC裂解。

关键：在4℃下执行该程序。

a.通过70 μm无菌滤器过滤消化的细胞，并将细胞收集在2 mL Eppendorf管中。

b.在4 ℃下离心细胞（4500 g，1 min），并通过抽吸弃去上清液。

注：使用高速（4500 g）离心，以尽量缩短1.7 mL Eppendorf管中的处理时间。或者，可以使用15 mL锥形管的标准方案（300 g，5 min）。高速离心不会严重影响内皮细胞的活力。

c.轻轻吸取1 mL ACK裂解缓冲液中的沉淀物，并在4℃下孵育3 min。

关键：避免剧烈移液。

d.在4℃下离心细胞（4500 g，1 min），并吸弃去上清液。

10.将细胞重悬于400 μL MACS缓冲液中，通过30 μm无菌滤器过滤细胞，并将细胞收集于1.5 mL Eppendorf管中。

注：当处理两个以上肺时，将细胞重悬于400 μL MACS缓冲液/肺中，然后将其合并，过滤细胞，再将细胞等分至400 μL/1.5 mL Eppendorf管中。

11.向细胞悬液中加入40 μL Anti-CD45磁珠、40 μL Anti-Ter119磁珠和40 μL Anti- CD326（EpCAM）磁珠，并在4℃下孵育45分钟。

注：本方法用于分离肺内皮细胞。使用Anti-CD45（免疫细胞）、Ter119（红系细胞）和CD326（EpCAM；上皮细胞）进行阴性选择，然后使用CD31（内皮细胞）进行阳性选择。

12.使用LS色谱柱进行负磁性分选。

注：当处理两个以上肺组织样本时，每个肺使用一个LS色谱柱。

a.用5 mL MACS缓冲液收集细胞3次，置于15 mL锥形管中，同时用磁性支架固定色谱柱。

b.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

13.用400 μL MACS缓冲液重悬15 mL锥形管中的细胞，并将细胞转移至1.5 mL Eppendorf管中。

14.向细胞悬液中加入40 μL Anti-CD31磁珠，并在4℃下孵育45 min。

15.在孵育过程中，制备明胶包被的细胞培养板。

注：处理两个以上肺时，每个肺准备一个培养皿。

a.将37℃孵育的0.2%明胶溶液涂布至10 cm培养皿中。通常，4mL溶液可覆盖一个10cm培养皿。

b.将明胶覆盖的培养皿在细胞培养箱中于37℃下孵育15分钟。

注：孵育时间可增加至4小时。

c.吸取明胶溶液，用PBS洗涤培养皿2次。

d.在细胞培养罩中，室温下干燥培养皿15分钟。

16.使用步骤14中的细胞，使用LS色谱柱进行正磁性分选。

注：当处理多个肺时，每个肺使用一个LS柱。

a.用5 mL MACS缓冲液清洗色谱柱3次，同时用磁性支架固定色谱柱。

b.将色谱柱与MACS磁性支架分离，并使用5 mL MACS缓冲液将细胞收集至15 mL锥形管中2次。

c.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

17.用12 mL LuEC生长培养基重悬细胞团块，并在明胶包被平板上培养，直至细胞达到80%-90%融合。

a.每只小鼠在一个培养皿中培养细胞。一般从一个肺中收集5-8 ×10^5个细胞。我们在每个10 cm培养皿中最多培养8×10^5个细胞。

b.通常，细胞在6-7天内达到80%-90%汇合。

c.每隔一天更换一次LuEC生长培养基。

Day 7：2h

18.将细胞从平板上分离，进行二次分选。

关键：二次分选是获得高纯度LuECs的关键步骤。

a.吸取培养基，用PBS洗涤培养皿2次。

b.向培养皿中加入2 mL无酶细胞解离缓冲液。

关键：应避免使用细胞解离酶（如胰蛋白酶）进行二次分选。

c.将培养皿在37℃下孵育5分钟。

d.使用细胞提升器分离细胞。

e.用2 mL DMEM（10%FBS和1%青霉素-链霉素）停止解离，并将细胞收集至15 mL锥形管中。

f.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

19.将细胞重悬于400 μL MACS缓冲液/培养皿中，并将400 μL分装至每个Eppendorf管中。

20.向细胞悬液中加入40 μL Anti-CD 31磁珠/管，并在4℃下孵育45分钟。

21.在孵育过程中，制备明胶包被的细胞培养板。

a.将37℃孵育的0.2%明胶溶液涂布至10 cm培养皿中。通常，4 mL溶液可覆盖一个10 cm培养皿。

b.将明胶覆盖的培养皿在细胞培养箱中于37℃下孵育15分钟。

c.吸取明胶溶液，用PBS洗涤培养皿2次。

d.在细胞培养罩中，室温干燥培养皿15分钟。

22. 使用来自步骤20的细胞，使用LS柱进行正磁性分选。

注：处理多个肺时，每个肺使用一个LS柱。

a.用5 mL MACS缓冲液清洗色谱柱3次，同时用磁性支架固定色谱柱。

b.将色谱柱与MACS磁性支架分离，并使用5 mL MACS缓冲液将细胞收集至15 mL锥形管中2次。

c.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），吸弃上清液。

23.用12 mL LuEC生长培养基重悬细胞团块，并在明胶包被平板上培养，直至细胞达到80%-90%融合。

a.在每个肺的一个培养皿中培养细胞。

b.通常，细胞在3-4天内达到80%-90%汇合。

c.每隔一天更换一次LuEC生长培养基。

Day11：LuEC传代：1 h

24.在37 ℃下制备0.2%明胶溶液、胰蛋白酶-EDTA和LuEC生长培养基。

25.在LuEC传代前，制备明胶包被的细胞培养板。

注：按1：5的比例传代LuEC。

a.将37℃孵育的0.2%明胶溶液涂布至10 cm培养皿中。通常，4 mL溶液可覆盖一个10 cm培养皿。

b.将明胶覆盖的培养皿在细胞培养箱中于37℃下孵育15分钟。

c.吸取明胶溶液，用PBS洗涤培养皿2次。

d.在细胞培养罩中，室温干燥培养皿15分钟。

26.传代LuEC。

a.用PBS洗涤细胞2次。

b.向平板中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下孵育，直至细胞分离。通常，LuEC在2-4分钟内分离。

c.加入0.5 mL FBS灭活胰蛋白酶。

d.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

e.用12 mL LuEC生长培养基/培养皿重悬细胞，并在明胶包被平板上培养，直至细胞达到80%-90%融合。

f.按1：5的比例传代细胞。

g.通常，细胞在3-4天内达到80%-90%汇合。

h.每隔一天更换一次LuEC生长培养基。

Day14：LuEC冻存：1 h

27.在37℃下制备胰蛋白酶-EDTA。制备冰冷的LuEC生长培养基和冰冷的FBS。

28.LuEC冷冻保存。

a.用PBS洗涤细胞2次。

b.向平板中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下孵育，直至细胞分离。通常，LuEC在2-4分钟内分离。

c.通过加入0.5 mL FBS灭活胰蛋白酶。

d.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

e.用LuEC生长培养基重悬细胞并计数。

注：每只小鼠获得5-10x10^6个LuEC。为了增加LuEC的数量，可将细胞扩增至第3代。直至第3代的LuEC均支持LO培养，无差异。

f.加入LuEC生长培养基，达到1.1×10^6个细胞/mL，然后加入10% DMSO。

g.将细胞以1 mL/瓶分装至低温小瓶中，并使用冷冻容器在-80℃下储存。

h.第二天，将小瓶移入液氮罐中。

注：在-80℃下储存LuEC会降低细胞活力和生长速率。

图1 小鼠肺内皮细胞培养的示意性过程。

肺类器官培养

Day 1：45min

29.在37℃下制备0.2%明胶溶液、DMEM（10%FBS和1%青霉素-链霉素）和LuEC生长培养基。

注：如果LuEC储存在-80℃下，则在LO培养前7天进行培养。与储存在液氮罐中的细胞相比，它需要更多的时间来生长。

注：通常情况下，从一个冻存管培养的LuEC平板可培养超过20个孔的LO，当其融合至70%-80%时。

30.在培养LuEC之前，制备明胶包被的细胞培养板。

a.将37℃孵育的0.2%明胶溶液涂布至10 cm培养皿中。通常，4 mL溶液可覆盖一个10 cm培养皿。

b将明胶覆盖的培养皿在细胞培养箱中于37℃下孵育15分钟。

c.吸取明胶溶液，用PBS洗涤培养皿2次。

d.在细胞培养罩中，室温干燥培养皿15分钟。

31.培养LuEC。

a.将含有LuEC的冷冻管置于37℃下，直至其解冻。

b.将LuEC从冷冻管转移至15 mL锥形管中。

c.向细胞中加入9 mL DMEM完全培养基。

d.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

e.用12 mL LuEC生长培养基重悬冷冻管中的全细胞。然后，在明胶包被板上培养细胞，直至细胞达到70%-90%融合。

注：培养皿中培养的LuEC的一个冷冻管可培养超过20个孔的LO。一个LuEC培养皿可以在3天内扩增超过2×10^6个细胞。

关键：LuEC的汇合显著影响细胞生长。在10 cm培养皿上培养至少一个冷冻管中的所有细胞。如果需要，可在一个10 cm培养皿中培养多个冷冻管，具体取决于冷冻保存后的细胞活力。

f.它们可用于LO培养。

Day 4：4h

32.制备冰、冰冷ACK缓冲液、冰冷MACS缓冲液和冰冷LO生长培养基。

33.在4℃下解冻等分的基底膜。

注：我们在开始LO培养前解冻基底膜。基底膜应在使用前至少解冻1小时。解冻的基底膜可在4 ℃下保存长达24 h。

34.如上所述（步骤3-10），收集并解离小鼠肺组织，然后将其重悬于MACS缓冲液中。

注：测试了不同年龄（6-22周龄）的小鼠进行LO培养。老年小鼠表现出相对缓慢的生长和降低的类器官形成效率。至少，来自22周龄小鼠的肺上皮细胞形成LO良好，直到第3代。

35.向细胞悬液中加入40 μL Anti-CD45磁珠、40 μL Anti-Ter119磁珠和40 μL Anti-CD31磁珠，并在4℃下孵育45 min。

注：本操作用于分离用于LO培养的肺上皮细胞。使用Anti-CD45（免疫细胞）、Ter119（红系细胞）和CD31（内皮细胞）进行阴性选择，然后使用CD326（EpCAM；上皮细胞）进行阳性选择。

36.使用LS色谱柱进行负磁性分选。

37.将细胞重悬于400 μL MACS缓冲液中，并将细胞收集于1.5 mL Eppendorf管中。

注：当处理两个以上肺时，将细胞重悬于400 μL MACS缓冲液/肺中，并在每个试管中分装400 μL。

38.向细胞悬液中加入40 μL抗小鼠CD 326（EpCAM）磁珠，并在4℃下孵育45分钟。

39.在孵育过程中，制备步骤31中培养的LuEC。

a.用PBS洗涤细胞2次。

b.向平板中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下孵育，直至细胞脱离。

c.通过加入0.5 mL FBS灭活胰蛋白酶。

d.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

e.将细胞重悬于每皿1 mL LO生长培养基中，然后计数细胞。

f.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

g.用冰冷的基底膜以1×10^6个细胞/mL重悬细胞，并将其置于冰上。

40.使用步骤38中的细胞，使用LS柱进行正磁性分选。

注：处理多个肺时，每个肺使用一个LS柱。

a.用5 mL MACS缓冲液清洗色谱柱3次，同时用磁性支架固定色谱柱。

b.将色谱柱与MACS磁性支架分离，并使用5 mL MACS缓冲液将细胞收集至15 mL锥形管中2次。

c.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

d.用1 mL LO生长培养基重悬细胞团块，然后计数细胞。

注：一般情况下，从一只小鼠中可获得1-2×10^6个肺上皮细胞。

e.加入LO生长培养基，使细胞密度为2×10^5个细胞/mL。

41.培养LO。

a.LO培养物的一个孔含有5×10^4个LuEC和1×10^4个肺上皮细胞。

b.在基膜中混合50 μL/孔的LuEC（来自步骤39）和在LO生长培养基中混合50 μL/孔的肺上皮细胞（来自步骤40），并通过移液轻轻混合。

c.将100 μL/孔的LuEC和肺上皮细胞混合物（来自步骤41b）加入到具有0.4 μm孔的transwell顶部。

关键：轻轻移液，避免产生气泡。

d.将transwell板在37℃下孵育30分钟，以固化基底膜。

e.孵育期间，将LO培养基置于37℃下。

f.在transwell底部加入500 μL LO培养基。

g.每隔一天更换一次LO培养基。

h.在培养2-3天时，在显微镜下可以看到小的LO。LO可培养长达14天。

图3 小鼠肺类器官培养的示意性过程。

图4 肺类器官培养和病毒感染过程。

类器官传代

Day1：45min

42.在37℃下制备0.2%明胶溶液、DMEM（10%FBS和1%青霉素-链霉素）和LuEC生长培养基。

43.按照上述步骤30和31，制备用于LO传代的LuEC。

44.准备冰、冰冷LO培养基、冰冷FBS、冰冷PBS。在37℃下制备胰蛋白酶-EDTA。

45.在传代LO前至少2小时，在4℃下解冻等分的基膜。

46.弃去transwell底部的培养基，并将平板置于冰上。

47.在transwell底部加入500 μL冰冷PBS。

48.在transwell顶部加入200 μL冰冷PBS，轻轻移液以溶解基底膜。

49.将含有LO的溶解基膜收集至1.5 mL Eppendorf管中。

50.在4℃下离心细胞（4500 g，1 min），小心移液弃去上清液。

注：使用1.7 mL Eppendorf离心管进行高速（4500 g）离心，以尽量缩短处理时间。或使用15 mL锥形管的标准方案（300 g，5 min）。高速离心不会严重影响细胞活力。

51.加入1 mL冰冷的PBS，轻轻移液。

52.在4℃下离心细胞（4500 g，1 min），小心移液弃去上清液。

53.加入500 μL胰蛋白酶-EDTA，轻轻移取，并在37℃下孵育30分钟。

54.孵育期间，制备步骤43中培养的LuEC。

a.用PBS洗涤细胞2次。

b.向平板中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在37℃下孵育，直至细胞脱离。

c.加入0.5 mL FBS灭活胰蛋白酶。

d.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

e.将细胞重悬于每皿1 mL LO生长培养基中，然后计数细胞。

f.在4℃下离心细胞（1000 g，5 min），并通过抽吸弃去上清液。

g.用冰冷的基底膜以1-3×10^6个细胞/mL重悬细胞，并将其置于冰上。

55.通过向LO中加入500 μL FBS灭活胰蛋白酶。

56.在4℃下离心细胞（4500 g，1 min），小心移液弃去上清液。

57.加入1 mL LO培养基，然后计数细胞。

58.加入LO生长培养基，使细胞密度为2×10^5个细胞/mL。

59.培养LO。

a.LO培养物的一个孔含有5×10^4个LuEC和1×10^4个肺上皮细胞。

b.混合基膜中50 μL/孔的LuEC（来自步骤54）和LO生长培养基中50 μL/孔的肺上皮细胞（来自步骤58），并通过移液轻轻混合。

注：一孔LO培养物含有5×10^4个LuEC和1×10^4个肺上皮细胞。

c.将100 μL/孔的LuEC和肺上皮细胞混合物（来自步骤59b）加入到具有0.4 μm孔的transwell顶部。

关键：轻轻移液，避免产生气泡。

d.将transwell板在37℃下孵育30分钟，以固化基底膜。

e.孵育期间，将LO培养基置于37℃下。

f.在transwell底部加入500 μL LO培养基。

g.每隔一天更换一次LO培养基。

慢病毒制备

Day 4：30分钟

60. 准备一个冰冷的PEG溶液。

61. 用0.45 μm注射器过滤器过滤病毒。

62. 将PEG溶液以1:3的比例加入培养基(PEG溶液1:含病毒的培养基3)。

63. 将病毒-PEG混合物通过剧烈摇动混合均匀，并在4℃孵育过夜。

注:将病毒-PEG混合物孵育至少4小时至24小时。

64.将293T细胞5×10^-4细胞/孔培养到48孔细胞培养板上。

注:这些细胞将用于病毒滴定。我们使用6个连续稀释的病毒和1个阴性对照，一式两份(7孔X重复=14孔)进行病毒滴定。

Day 5: 15h

65. 准备冰冷的LO培养基。

66. 4℃离心混合物（1600 g, 60 min），小心丢弃上清。

67. 用1 mL LO培养基重组病毒，4℃孵育15分钟。

68. 4℃离心病毒（20000 g, 3 min），收集上清，去除蛋白碎片。

69. 取35 μL病毒，连续稀释5-6倍。

注:此病毒的连续稀释将用于病毒滴定。以10 μL病毒为1x。依次稀释后的病毒将为1-0.00001x。

70. 将剩余的病毒分装并储存在−80℃。

71. 将连续稀释的病毒加入含有10 μg/mL聚凝胺的293T细胞中。

Day 7:1h

72.使用荧光显微镜测量病毒转导单位（TU）。滴度（TU）= N × F/V. N =转导细胞数，F =荧光细胞分数，V =病毒体积。（5×10^4个细胞×0.25 [25%表达荧光]）/（0.1 μL病毒（0.01 ×））= 2×10^6 TU/μL。

图5 慢病毒生产和浓缩过程示意图。

慢病毒转导

LO培养、LO感染

Day1：45min

73. 在37℃制备0.2%明胶溶液、DMEM (10% FBS和1%青霉素-链霉素)和LuEC生长培养基。

74. 如上述步骤30和31所述，为LO培养准备LuEC。

Day4：6h

75. 在4℃解冻储存的病毒和基膜。

76. 从LO中收获细胞，并按照类器官传代切片（类器官传代切片，步骤44-53，55-57）中描述的方法计数单个细胞。

77. 在LO生长培养基中制备含病毒培养基（500 μL中7 μg/mL）。

78. 向细胞沉淀中加入含聚凝胺的培养基，转移细胞悬液。

79. 在环境温度下，600 g将试管离心1小时（将温度设置为32℃）。

注:离心机20℃-25℃也适用。已经证实，感染效率与32℃处感染的细胞相当。

80. 将试管在37℃培养箱中孵育4小时。

81. 孵育30分钟前，准备步骤74培养的LuEC。

a.用PBS洗涤细胞2次。

b.在培养皿中加入2 mL胰蛋白酶，在37℃孵育至细胞分离。

c.加入0.5 mL FBS灭活胰蛋白酶。

d.将细胞（1000 g, 5分钟）在4℃离心，抽离上清。

e.将细胞重悬在每皿1 ml的LO培养基中，然后对细胞计数。

f.将细胞（1000 g, 5分钟）在4℃离心，抽离上清。

g.以1×10^6细胞/mL的低温基底膜重悬细胞，冰冻保存。

82. 将细胞（4500 g, 1min）在4℃离心，仔细移液丢弃上清。

注:含慢病毒的废液应适当丢弃。建议漂白(用10%的终漂白剂体积)20分钟。

83. 用1 mL LO生长培养基洗涤细胞，在4℃离心（4500 g, 1min），仔细移液丢弃上清。

84. 加入1 mL LO培养基，计数细胞。

85. 加入LO生长培养基，细胞密度为2×10^5细胞/mL。

注:肺类器官培养期间的抗生素选择是可用的。如果在LO中加入抗生素，肺上皮细胞数量可以增加到53个，这取决于感染效率。肺上皮细胞可以通过荧光活化细胞分选(FACS)进行分选，以最大限度地提高转导效率。

86.培养LO。

a.一个LO培养孔含有5×10^4个LuEC和1×10^4个肺上皮细胞。

b.将50 μL/孔的LuEC在基底膜（从步骤81开始）中混合， 将50 μL/孔的肺上皮细胞放入LO培养基中（从步骤85开始），并通过移液轻轻混合。

注：一个LO培养孔含有5x10^4个LuEC和1x10^4个肺上皮细胞。

c.将100 μL/孔的LuEC和肺上皮细胞混合物（从步骤86b开始）加入0.4 μm孔的transwell顶部。

关键：轻轻移液，避免产生气泡。

d.将transwell板在37℃上孵育30分钟以固化基底膜。

e.在孵育期间，将LO培养基放置在37℃。

f.在transwell底部加入500 μL LO培养基。

g.每隔一天更换一次LO培养基。

材料

参考文献

Kim B, Park JI. Protocol for establishing genetically engineered murine lung organoids mimicking cell plasticity and regeneration. STAR Protoc. 2025 Jun 20;6(3):103911. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103911.

来源：培养盒守护者