摘要：重庆大学雷明星教授团队利用表皮细胞、真皮细胞和黑色素祖细胞构建了皮肤类器官，成功再生出带色素的毛发，揭示了两条调控黑色素细胞分布的新通路，证实毛囊是其行为的关键调控中心，为预防白发提供了新的临床策略。
哺乳动物的毛色由黑色素细胞响应环境信号决定，但这些颜色模式在损伤或疾病时可能消失，具体机制尚不清楚。
重庆大学雷明星教授团队利用表皮细胞、真皮细胞和黑色素祖细胞构建了皮肤类器官，成功再生出带色素的毛发，揭示了两条调控黑色素细胞分布的新通路，证实毛囊是其行为的关键调控中心，为预防白发提供了新的临床策略。
文章介绍
题目：通过皮肤类器官再生头发色素沉着：胶原蛋白VI和信号蛋白3C介导的适应性模式
期刊：Advanced Science
影响因子：14.1
发表日期：2025年7月
#1
研究背景
Background
动物进化出了丰富多样的皮毛颜色，赋予了独特的适应优势。这些色素沉着模式形成背后的生物学原理一直是科学家们感兴趣的问题。
在皮肤的发育中，黑色素细胞起源于神经嵴细胞（NCC），经特化为成黑色素细胞后迁移至皮肤，最后定植于毛囊的隆起区域，其充当含有黑色素细胞干细胞的储库，以及围绕真皮乳头的毛发基质（HM），用于毛发色素沉着。
皮肤类器官是一种三维培养系统，可以模拟皮肤的复杂结构和功能，在探索细胞间相互作用和组织自组织方面具有独特的优势。此外，皮肤类器官可以在体内自组织和复制结构，因此它是研究动态组织定位黑色素细胞的极好模型。
研究表明，移植小鼠皮肤类器官能够生成与类器官小鼠来源相同颜色的毛发，这进一步证明了皮肤类器官模拟黑色素细胞发育的潜力。
然而，黑色素细胞如何在皮肤类器官形成期间从完全随机的状态组织到最终将其自身定位在设定的解剖位置并产生自适应图案以在移植后着色再生的毛发仍然需要广泛的研究。
#2
研究方法
Methods
将小鼠皮肤来源的表皮细胞和真皮细胞混合物构建生成皮肤类器官，并将其移植到无毛裸鼠中，观察胚胎皮肤发育阶段和皮肤类器官中黑色素的细胞定位。
然后通过对皮肤类器官进行单细胞RNA测序，鉴定了成纤维细胞分泌的COL6A3和黑色素细胞上的CD44的相互作用；并利用KEGG富集分析得到COL6A3-CD44的下游途径GSH代谢，并进行验证。
再对黑色素细胞与毛囊隆突细胞进行ScRNA-Seq分析并验证，确定了SEMA3C-NRP1在黑色素细胞的募集和功能的作用。
#3
关键研究结果
Results
1. 基于皮肤类器官的毛发再生中，黑色素细胞适应性模式化的细胞过程与胚胎皮肤发育期间观察到的细胞过程非常相似
利用从小鼠皮肤提取的表皮细胞和真皮细胞的混合物（包括黑色素细胞）构建皮肤类器官，并将其移植到无毛裸鼠中，21天后产生着色的毛发（图1A）。
图1 黑色素细胞谱系在体内发育和体外皮肤类器官中的时空定位。
移植皮肤的免疫荧光染色和Masson-Fontana染色显示，皮肤和毛囊的色素沉着早在移植后9天就开始了。黑色素细胞不仅功能活跃，而且对空间定位的局部线索高度敏感（图1B）。
图1 黑色素细胞谱系在体内发育和体外皮肤类器官中的时空定位。
接下来，采用黑色素细胞特异性标记物多巴色素互变异构酶（DCT）和酪氨酸酶（TYR）来追踪处于不同胚胎发育阶段小鼠皮肤中以及皮肤类器官中的黑色素细胞定位。
在胚胎发育阶段，黑色素细胞最初在胚胎第12.5天（E12.5）位于真皮中，但在E13.5开始迁移到表皮。到E14.5，随着毛囊的发育，表皮黑色素细胞聚集在真皮冷凝物周围。
出生后第0天（P0），黑色素细胞主要存在于完全发育的毛囊中，特别是在隆起和毛发基质中（图1C）。
图1 黑色素细胞谱系在体内发育和体外皮肤类器官中的时空定位。
在体外类器官发育期间，黑色素细胞最初在第2天（D2）在表皮和真皮层中；但在D7开始优先定位于表皮层，类似于在E13.5时观察到的模式。
移植到裸鼠体内后，出生后P5，黑色素细胞出现在发育中的毛囊中，与E14.5的模式相似；到P9，当毛囊完全形成时，黑色素细胞分布更广泛，包括真皮和表皮，但在隆起和毛发基质中仍然最丰富，密切反映了在P0时观察到的分布（图1D）。
这些结果证明了皮肤类器官和胚胎发育中黑色素细胞行为具有惊人相似性。
图1 黑色素细胞谱系在体内发育和体外皮肤类器官中的时空定位。
2. 鉴别皮肤类器官中黑色素细胞和成纤维细胞之间的相互作用
使用代表形态发生关键阶段时的皮肤类器官的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，鉴定了18个独特的细胞群，包括真皮细胞（FB1-5）、表皮细胞（SBC和BC）和黑色素细胞（Mel）。
CellChat分析细胞间的相互作用，结果显示，Mel（黑色素细胞）与FB3（成纤维细胞）和Peri（周细胞）相互作用最强，其中与FB3具有更强的预测相互作用并且更丰富。
进一步的生物信息学分析显示，胶原蛋白是来自FB3的最强配体，特别是预测Col6a3与Mel上的受体Cd44的相互作用。随着皮肤类器官的发育，Col6a3-Cd44配体/受体对的相互作用强度增加，类似于先前观察到的黑色素细胞和表皮细胞之间的时间相互作用。
此外，分别在FB3和Mel中检测到Col6a3和Cd44表达（图1J），并且通过Afold3预测它们的蛋白产物发生物理相互作用（图1K）。
图1 黑色素细胞谱系在体内发育和体外皮肤类器官中的时空定位。
3. COL6A3-CD44信号维持体内黑色素细胞
免疫染色结果显示，在两种模型中，分别在真皮和表皮隔室中特异性地检测到COL6和CD44，尽管CD44也在其他表皮细胞中表达（图2A-B）。
图2 COL6A3-CD44轴在调节黑素细胞组织和色素沉着中的功能表征。
使用人COL6A3重组蛋白（COL6A3-RP）或Angstrom 6（CD44抑制剂，iCD44）调节皮肤类器官中COL6A3-CD44的相互作用，并通过免疫染色观察黑色素细胞的行为。
在D2和D7时，与对照组相比，添加COL6A3-RP显著增加了黑色素细胞的数量并促进了局部黑素沉积，还诱导色素沉着毛发的生长；而抑制CD44导致相反的效果（图2CD）。这些结果有力地表明了COL6A3对黑色素细胞迁移和功能的调节作用。
图2 COL6A3-CD44轴在调节黑素细胞组织和色素沉着中的功能表征。
成熟的黑色素细胞主要位于毛基质区域，将黑色素转运到角质形成细胞，从而使毛干着色。COL6A3RP（重组蛋白）处理促进毛囊再生，而抑制CD44（iCD44）抑制毛囊再生（图3A-C）。
图3 COL6A3-CD44信号传导在皮肤类器官形态发生期间维持黑素细胞群体并调节毛发色素沉着。
与对照相比，COL6A3-RP处理显著增加了毛囊中黑色素细胞的数量和黑色素沉积的面积，而CD44抑制具有相反的效果（图3D-E）。
图3 COL6A3-CD44信号传导在皮肤类器官形态发生期间维持黑素细胞群体并调节毛发色素沉着。
又使用拔毛小鼠模型进一步检查了COL6A3-CD44相互作用在毛发生长期间的作用。与之前的发现一致，给予COL6A3-RP导致毛球中黑色素细胞和黑素沉积物的积累增加，而CD44抑制显著降低了这些作用（图3F-G）。
总的来说，这些结果证明来源于成纤维细胞（FB3）的COL6A 3通过与黑色素细胞上的CD44受体相互作用来调节黑色素细胞运输、存活和功能。
图3 COL6A3-CD44信号传导在皮肤类器官形态发生期间维持黑素细胞群体并调节毛发色素沉着。
4. COL6A3-CD44途径下游的谷胱甘肽代谢功能
总黑色素细胞群中的CD44+细胞的KEGG富集分析显示，最显著富集的途径是谷胱甘肽（GSH）代谢途径，并且在相关基因中，GSTA4表现出最高的倍数变化。
整合数据中提取的FB和Mel群体的ScMetabolism分析也揭示了黑色素细胞中显著的GSH代谢。这说明GSH代谢可能对黑色素细胞的存活和功能至关重要。因此，用GSH处理不同的发育阶段的皮肤类器官，并进行免疫荧光分析。
结果显示，给予外源性GSH显著减少了黑色素细胞的数量和黑色素分泌；GSH处理的皮肤类器官在移植到裸鼠后产生了无色素的毛发，进一步表明黑色素细胞或其功能的丧失（图4E-F）。
图4 CD44介导的谷胱甘肽途径活化增强黑素细胞的生态位和功能。
接下来评估了GSH处理后总体GSTA4+细胞的变化。同样地，COL6A3-RP给药后皮肤类器官中GSTA4+细胞的数量增加，但CD44抑制显著降低（图4G）。
图4 CD44介导的谷胱甘肽途径活化增强黑素细胞的生态位和功能。
进一步比较皮肤器官移植和拔毛诱导毛发再生后毛囊中黑色素细胞和黑色素沉积的数量，证明过量的GSH可能通过消除GSTA4+细胞而抑制GSH代谢，从而损害黑色素细胞的存活。
GSH处理后毛囊中的黑色素细胞急剧下降，导致移植物和拔毛后的黑素分泌显著减少，与Western blot一致。
总之，这些结果表明GSH代谢和黑色素细胞存活之间存在密切联系。
5. 黑色素细胞与隆突细胞间串扰的ScRNA-Seq分析
为了了解黑色素细胞如何首先被招募到隆突区域（Bu），获取新生小鼠细胞RNA测序数据，并分离黑色素细胞和隆突驻留干细胞。CellChat和Secreted Signaling插件分析得到了几种可能促进Bu和Mel之间串扰的突出配体受体对，进一步的分析显示，Sema3c-（Nrp1+Plxna4）特异性表达。
此外，AlphaFold 3辅助蛋白质对接显示SEMA3C-NRP1的Z评分更高，表明该配体-受体对之间的相互作用更有可能。因此，评估了SEMA3C和NRP1在新生小鼠皮肤类器官移植物和毛囊中的表达特征。
在这两种情况下，发现SEMA3C与SOX9、NRP1与DCT或TYR的明显重叠（图5E-F），分别表明SEMA3C从隆突细胞表达和NRP1从黑色素细胞表达。这些数据共同表明，通过SEMA3C和NRP1的旁分泌机制，隆突细胞和黑色素细胞之间可能存在功能关系。
图5 通过SEMA3C-NRP1轴的黑素细胞和隆突细胞之间的相互作用增强黑素细胞的募集和功能。
6. SEMA3C-NRP1促进黑色素细胞向隆突的募集
接下来研究了SEMA3C-NRP1信号传导在黑色素细胞向隆突区域募集到隆突区域中的作用。将皮肤类器官移植到裸鼠中，并在21天后监测移植部位的毛发生长和色素沉着。
用SEMA3C重组蛋白（SEMA3C-RP）处理导致毛干色素沉着过度，尽管与对照组相比毛发再生不太稳健；而NRP1的抑制（iNRP1）阻断了毛发再生并减少了毛发色素沉着（图6A）。
图6. SEMA3C-NRP1轴在黑素细胞模式形成中的功能表征。
免疫荧光染色显示，SEMA3C-RP增加了隆突和毛发基质中黑色素细胞的数量，而MasontFontana染色显示毛发基质中黑素沉积增加，可能导致移植毛发色素沉着过度；而iNRP1处理几乎消除了所有黑色素细胞，仅留下极少量的黑色素沉积物（图6D）。采用拔毛模型进行进一步验证，得到了同样的结果。
总之，结果表明，从隆突细胞释放的SEMA3C通过其表面受体NRP 1调节黑色素细胞的募集和功能。
图6. SEMA3C-NRP1轴在黑素细胞模式形成中的功能表征。
7. Nrp1下游Tubb2b的功能研究
对黑色素细胞中的差异表达基因（DEG）进行了KEGG富集分析，得到前三种富集途径，其中，Tubb2B在黑色素细胞中特异性高表达。
然后，用TUBB2B-RP和iTUBB2B处理皮肤类器官，均抑制了毛发再生，但能够鉴定出几个完全形成的毛囊，其中在TUBB2B-RP处理后，毛发基质中的黑色素细胞和黑素沉积增加；而TUBB2B的抑制导致总黑色素细胞的显著减少和毛发基质中黑素沉积物的完全损失（图7E-G）。这在毛发拔除模型中得到进一步验证。
综上所述，黑色素细胞的适应性模式依赖于β-tubulin，这可能有助于其在接受局部刺激如SEMA3C后的迁移潜力。
图7 NRP1-TUBB2B调节黑素细胞向毛囊隆突的迁移。
结论
该研究揭示了一种以前未被认识到的双重机制，在毛囊发育和再生过程中协调黑色素细胞的命运。
结果证明，早期的COL6A3-CD44-GSH轴通过减轻氧化应激维持黑色素细胞群体，而后期的SEMA3C-NRP1-TUBB2B通路则引导黑色素细胞回到毛囊生态位，以实现色素沉着和组织图案化。
虽然这些途径在功能上似乎不同，但任何一种途径的破坏都会导致黑色素细胞的显著损失，表明它们相互依赖。
这些机制在卵泡发育过程中协同调节黑色素细胞的行为。靶向COL6A3-CD44和SEMA3C-NRP1通路，为开发白癜风等色素沉着疾病的创新治疗奠定了令人信服的理论基础。
参考文献
Li T, Li X, Xiang X, Huang J, Shen X, Wang M, Jiang J, Shao S, Li Z, Xie T, Liu D, Zhao Y, Ma R, Wu W, Shi W, Chuong CM, Li J, Lei M. Regenerative Hair Pigmentation via Skin Organoids: Adaptive Patterning Mediated by Collagen VI and Semaphorin 3C. Adv Sci (Weinh). 2025 Jul 3:e02436. doi: 10.1002/advs.202502436.
来源：培养盒守护者