摘要：重组蛋白是现代生物技术和制药工业的重要研究对象，涉及结构生物学、代谢工程、抗体药物、疫苗研发等多个领域。如何高效获得高纯度且保持生物学功能的重组蛋白，是实验室和产业化生产的共同目标。在所有蛋白表达系统中，大肠杆菌蛋白表达纯化已成为最成熟和应用最广泛的方式。作为

重组蛋白是现代生物技术和制药工业的重要研究对象，涉及结构生物学、代谢工程、抗体药物、疫苗研发等多个领域。如何高效获得高纯度且保持生物学功能的重组蛋白，是实验室和产业化生产的共同目标。在所有蛋白表达系统中，大肠杆菌蛋白表达纯化已成为最成熟和应用最广泛的方式。作为典型的原核表达系统，大肠杆菌（Escherichia coli）凭借生长快、操作简便、表达量高和成本低等优点，常被用于原核蛋白表达。然而，该系统在复杂翻译后修饰、蛋白折叠和功能性表达方面仍存在一定挑战，因此如何实现高效的蛋白功能活性表达成为研究焦点。

原核蛋白表达宿主菌株的选择

BL21(DE3)：最常用，缺乏Lon和OmpT蛋白酶，降低降解风险。

Rosetta系列：携带稀有tRNA基因，解决密码子偏好问题。

Origami/SHuffle：胞质内氧化环境有利于二硫键形成，适合分泌蛋白或含二硫键的酶类。

C41/C43：对毒性蛋白具有更强的耐受性。

优化策略：提高蛋白可溶性与功能活性表达

高表达量带来的常见问题是目的蛋白易形成包涵体，影响后续功能性回收。文献提出多项优化策略，助力蛋白功能活性表达：

1. 密码子优化与稀有密码子补偿

外源基因中如果存在宿主稀有密码子，可能导致表达效率低或提前终止。可通过密码子优化或使用Rosetta/Rosetta2等补偿菌株改善表达。

2. 融合标签增强溶出与纯化便捷

将目标蛋白与MBP、GST、SUMO、HaloTag等融合，可以提升表达可溶性并兼具亲和纯化便捷性，便于实现蛋白功能活性表达。

控制诱导温度、IPTG浓度、诱导时间，调整表达速率，有助于减轻宿主细胞负担，提高蛋白折叠质量与产量。

最新研究指出，减缓外源蛋白合成速率（“less is more”原则）在多项情况下可提升功能性表达，提升产量。

4. 分泌路径与氧化环境优化

对于需形成二硫键或在氧化环境下折叠的蛋白，可利用Periplasm表达或特化菌株（如Origami等），促进正确折叠。

纯化方案：标签与层析技术结合

大肠杆菌蛋白表达纯化常依赖亲和标签及层析技术：

His-tag亲和层析：His-标签结合Ni²⁺或Co²⁺树脂，通过洗脱剂（如高浓度咪唑）可有效纯化目标蛋白。

Strep-tag系统：Strep-tag II与Strep-Tactin杂结合，纯化过程中温和条件有助于保持蛋白活性。

表达功能活性蛋白典型案例解析

例如一项针对E. coli YhbO蛋白的研究：该蛋白 在BL21(DE3)中使用T7启动子诱导表达，以DEAE离子交换层析联合羟基磷灰石层析实现纯化，最终获得多寡聚状态下纯化蛋白，验证解析结构与构象特征，体现了从表达到纯化再到功能/结构分析的完整流程。

原核蛋白表达技术进展与趋势

近年综述指出，E. coli平台虽已广泛应用，但仍存在许多技术瓶颈和改进空间：

外源蛋白过表达对宿主代谢产成严重负担，需优化表达速率、翻译调控机制，有研究使用CASPON™融合系统（solubility + His-tag +可切除酶位点）显著提高表达效率和纯化便利性。

2、分子建模预测表达优化

研究者通过系统建模宿主折叠与氧化能力，以指导表达策略（如控制二硫键形成条件）。

3、人工智能与高通量筛选

AI技术、CRISPR库策略、表达条件大规模筛选等方法正用于快速找到高功能性表达条件或宿主变体。

大肠杆菌蛋白表达纯化技术依托于成熟的原核表达系统，在基础研究和应用开发中展现了高效性与普适性。通过对宿主菌株、载体构建、表达条件及融合标签的系统优化，可以有效提高原核蛋白表达的成功率，并在很大程度上实现目标蛋白的功能活性表达。随着人工智能、合成生物学及高通量筛选等新技术的引入，大肠杆菌平台的表达效率与蛋白质量将进一步提升。未来，该体系不仅将在结构解析与机制研究中继续发挥核心作用，还将在生物制药、工业酶制剂和新型蛋白产品开发等领域展现更广阔的应用前景。

来源：积极的辰小创