摘要：溃疡性结肠炎（UC）是一种容易复发性疾病，发病率和患病率越来越高，其特征是结肠和直肠反复和持续的炎症和溃疡，病因复杂且多因素，涉及遗传、环境、微生物和免疫因素。多糖是由许多通过糖苷键连接的单糖组成的天然大分子，具有多种生物学作用，其中多糖的抗炎潜力引起了许多关
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导读
溃疡性结肠炎（UC）是一种容易复发性疾病，发病率和患病率越来越高，其特征是结肠和直肠反复和持续的炎症和溃疡，病因复杂且多因素，涉及遗传、环境、微生物和免疫因素。多糖是由许多通过糖苷键连接的单糖组成的天然大分子，具有多种生物学作用，其中多糖的抗炎潜力引起了许多关注，因为炎症是结肠炎、糖尿病和心血管疾病等许多慢性病的主要因素。特别是膳食多糖因其对UC的治疗作用和安全性而成为近年来的研究热点。之前的研究表明，余甘子果胶多糖（PEP-1）可以缓解右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的UC小鼠，但其深层机制仍然不清楚。在此，本研究旨在利用多糖-代谢组学-转录组学（PMT）方法进一步揭示PEP-1抗炎作用背后的潜在机制。PEP-1干预改变了血清代谢物含量和途径，表现为黄嘌呤和鞘氨醇水平降低。基因表达的变化与炎症因子、结直肠癌癌症启动子和NF-κB通路表达的抑制以及紧密连接的增强导致的代谢产物变化相关。本研究表明，慢性UC的改善作用部分归因于血清代谢物的改变和基因表达的变化。
论文ID
原名：Transcriptomics and metabolomics reveal the alleviation effect of pectic polysaccharide on dextran sodium sulfate-induced colitis mice
译名：代谢组学和转录组学揭示了余甘子果胶多糖对右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠结肠炎的缓解作用
期刊：International Journal of Biological Macromolecules
IF：7.7
发表时间：2024.12
通讯作者：曹庸，余以刚，肖航
通讯作者单位：华南农业大学，华南理工大学，马萨诸塞大学阿默斯特分校
实验设计
实验结果
1. PEP-1减少结肠黏液损伤
黏液层在肠道中起着关键的物理屏障作用，保护身体免受有害细菌和毒素的侵害。为了评估DSS和PEP-1治疗对小鼠黏液层的影响，我们采用了阿利新蓝-过碘酸-雪夫试剂（AB-PAS）染色。结果显示了结肠黏膜的完整性和杯状细胞的形态，以及酸性黏液物质的存在。在对照组中，小鼠结肠组织显示出丰富的杯状细胞和坚硬的黏液层。相反，DSS诱导导致杯状细胞显著减少，黏液层受损。这种减少伴随着杯状细胞和肠腺分泌的酸性黏液物质的减少。值得注意的是，在低剂量和高剂量PEP-1组中，这些情况都得到了逆转，特别是在高剂量组（图1b）。因此，可以得出结论，PEP-1给药表现出缓解性杯状细胞减少和黏膜层破坏，这在DSS模型组中是严重的。
图1 （a）动物实验步骤；（b）PEP-1对结肠炎小鼠黏液的影响，附小鼠结肠组织AB-PAS染色图像（放大100倍和200倍）。
图S1 PEP-1对DSS诱导的结肠炎小鼠的影响。（a）体重变化。（b）疾病活动指数（DAI）评分。（c）脾脏指数。（d）结肠长度。（e）小鼠结肠的代表性图像；PEP-1对小鼠结肠组织天冬氨酸转氨酶(AST)（f）、丙氨酸转氨酶(ALT)（g）、TNF-α（h）、白细胞介素(IL)-10（i）和IL-6（j）血清水平的影响。数据以SEM的平均值显示。显著性水平：*p＜0.05，**p＜0.01，***p
2. 血清代谢组学分析
膳食纤维是肠道细菌的主要营养物质，在炎症性肠病（IBD）的发展中起着关键作用，代谢产物是宿主和微生物群之间的关键介质。在之前的研究中，我们研究了肠道微生物组和粪便代谢物的变化。事实证明，补充PEP-1改变了粪便代谢物和代谢途径。此外，在这项研究中，我们使用LTQ-Orbitrap-Velos LC/MS系统将我们的分析扩展到PEP-1给药后的血清代谢物，在正离子和负离子模型下分别识别出488和306个离子特征。PCA（主成分分析）是一种广泛使用的无监督分析方法，用于获得对每组样本之间总代谢物差异和组内样本之间变异性的一般理解。PLS-DA（偏最小二乘判别分析）是一种监督判别分析方法，可以获得比PCA更好的分离结果。为了分析血清代谢组学特征的差异，我们采用了PCA和PLS-DA。如图2a和2b所示，我们观察到对照组和模型组之间存在显著差异。低剂量（PEPL）和高剂量（PEPH）组在正离子模式下与对照组有很大重叠，PEPH在负离子模式下也有类似的重叠。这些发现表明，DSS诱导导致血清代谢组谱的变化，PEP-1给药部分逆转了这些变化。图2c和2d进一步显示了模型组和PEP-1治疗组之间的明显分离。我们通过|log2（FC）|＞1以及p值 1选择显著不同的代谢物。如图2e所示，与对照组、PEPL组和PEPH组相比，模型组在正离子模式下产生的代谢物有54、71和59种显著不同。在负离子模式下，模型组与对照组、PEPL组和PEPH组分别有65、24和27种显著不同的代谢物。在这两到三次比较中重叠的显著差异的代谢物被选择出来，我们使用MetaboAnalyst 6.0映射到KEGG和SMPDB通路中，以分析通路富集。同时，我们在OmicStudio网站上对这些代谢物进行了层次聚类分析，并根据其峰值评级生成了热图（图3a）。图3b和3c显示，最丰富的途径是鞘脂代谢、嘌呤代谢以及亚精胺和精胺生物合成。鞘脂代谢与炎症的进展特别相关。鞘氨醇激酶抑制剂已被证明可以减轻结肠炎的严重程度、细胞因子的产生和全身炎症反应。在我们的研究中，该通路上的鞘氨醇（也称为二氢鞘氨醇）和植物鞘氨醇在模型组中上调，在PEP-1治疗后下调。之前有报道称，结肠炎患者的血清样本中3-脱氢鞘氨醇（与鞘氨醇功能相关）和植物鞘氨醇水平升高。嘌呤代谢途径上的黄嘌呤在DSS模型组中升高，在PEPL和PEPH组中降低。Chen等人报道，在大肠癌癌症的发展过程中，宿主的尿素循环代谢被激活，这通常与具有解尿能力的肠道微生物的丧失有关。黄嘌呤氧化酶可以将黄嘌呤转化为尿酸，先前的研究表明，黄嘌呤氧化酶活性的增加可能导致肝脏氧化应激，激活NF-κB，加剧I型糖尿病大鼠的炎症。然而，黄嘌呤在这种情况下的具体作用值得进一步研究。此外，我们之前发表的文章表明，DSS模型组粪便样本中的胸苷水平升高，但在PEP-1治疗后降低。我们在血清样本中也观察到了这一趋势。之前对各种动物物种和人类的研究表明，血清和尿液中胸苷浓度升高与炎症过程有关。从上述结果可以得出结论，血清代谢物和代谢途径的变化在缓解DSS引起的慢性炎症症状方面发挥着重要作用，强调了PEP-1在治疗IBD方面的潜在治疗益处。
图2 正离子（ESI+）模式（a）和负离子（ESI-）模式（b）下四组的PCA；模型组和PEP-1低、高剂量组在正离子（ESI+）模式（c）和负离子（ESI-）模式（d）下的PLS-DA；每组中总代谢物和差异代谢物的数量。
图3 非靶向代谢组学揭示了PEP-1给药后DSS诱导的结肠炎小鼠血清代谢物谱的改变。（a）热图显示了不同组（n=5）中显著差异代谢物的表达水平。红色越深，含量越高；同样，蓝色越深，含量越低；（b）KEGG对调节代谢途径的富集集；（c）SMPDB调节代谢途径的富集集；（d）四组关键差异血清代谢物的变化。
3. PEP-1对转录谱的影响
不同的基因表达通常与身体的功能变化有关。持续的慢性结肠炎症通常会导致结肠上皮细胞的基因改变，导致异常的细胞增殖、细胞分裂，并增加患癌症的风险。为了研究PEP-1的抗炎作用和潜在的分子机制，我们进行了RNA-seq转录组分析，以确定对照组、模型组和PEPH组之间的基因表达变化。与对照组相比，DSS诱导的模型组中鉴定出589个DEGs，包括288个上调和310个下调的DEGs（图4b）。在PEPH和模型组之间的比较中，我们筛选出275个DEGs（209个上调，66个下调）（图4c）。基于表达相似性的层次聚类分析表明，PEPH组与对照组的相似性比与模型组的相似之处更多（图4e）。维恩图描绘了不同基因集中的共同和独特基因。它还表明，模型与对照组（598）比较的DEGs几乎是PEPH与对照组的比较（312）的两倍，表明PEPH组的基因表达与对照组更相似（图4d）。PEP-1的给药减少了DSS诱导引起的结肠上皮细胞的遗传改变。如图4d所示，模型与对照组比较和PEPH与模型比较显示，共有109个DEGs，PEPH与模式比较与PEPH与对照比较共有50个相同的DEGs。然后，我们根据KEGG通路对DEG进行功能注释分析。大多数DEG与代谢和生物系统等类别有关，功能水平最丰富，包括信号转导、免疫系统和传染病（图4e）。通路富集分析表明，与对照组相比，模型组的DEGs主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用以及IL-17信号通路有关。与模型组相比，高剂量PEP-1后鉴定的DEGs大多富集于病毒蛋白与细胞因子和受体的相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性黏附和核因子κB（NF-κB）等途径（图5a和5b）。值得注意的是，炎症因子和趋化因子在模型组中的表达增强，然后在PEP-1处理后降低。Nfil3被认为是IL-3启动子的转录激活因子，被鉴定为参与锯缘青蟹（Scylla paramamosain）先天免疫的NF-κB通路激活因子。在模型组中，Nfil3表达的升高表明存在潜在的炎症反应，而在PEPH组中，其表达的减少突显了该化合物的保护作用。然而，位于NF-κB通路中的P65和TLR4在这三组中没有显著变化。因此，有必要进一步验证它们的蛋白质水平，以充分了解它们的参与。Cemip，一种促进结直肠癌癌症进展和转移的相关生物标志物，在模型组中也增加，在PEPH组中减少。我们构建了上皮屏障的紧密连接的基因表达，如Cldn1、Cldn5和Ocln，在模型组中降低，在PEPH组中增加（图5d）。上皮紧密连接对肠屏障的通透性至关重要。紧密连接的较低表达表明了通透性的增加，这使得未经选择的物质能够通过肠屏障。肠屏障通透性增加的恢复通常与黏膜愈合和通透性降低有关。PEPH组中炎症因子和结直肠癌癌症启动子的表达抑制意味着在分子水平上可以改善高剂量PEP-1组的炎症。同时，与上皮屏障增强和黏膜愈合相关的紧密连接蛋白的表达促进也与PEP-1治疗后黏膜完整性改善的组织学观察结果一致，表明这是治疗慢性结肠炎的潜在治疗途径。
图4 （a）不同组中标准化DEGs表达的聚类热图，（b）模型组与对照组中差异代谢物的火山图，（c）PEPH组与模型组中差异代谢产物的火山图；（d）模型与对照组比较、PEPH与模型比较和PEPH与对照组比较中差异表达的基因数量的维恩图，（e）基于KEGG的DEGs功能注释分析。
图5 KEGG功能富集分析（a）模型与对照组比较和（b）PEPH与模型比较（通路富集），（c和d）对照组、模型组和PEPH组关键基因的mRNA倍数变化。与模型组相比，（∗）p＜0.05和（**）p＜0.01。
4. PEP-1对蛋白质表达的影响
为了证实观察到的转录变化，我们使用蛋白质印迹和IHC来确定结肠组织中的蛋白质表达。值得注意的是，Ocln和ZO-1的紧密连接蛋白在模型组中下调，在PEPH组中显著上调，这与转录谱结果一致。PEPH组中Ocln和ZO-1蛋白水平的增加进一步支持了PEP-1增强上皮屏障和保护黏膜层的假设。此外，在DSS诱导的模型组中，NF-κB通路中TLR4和P65的蛋白水平升高，在PEP-1干预后显著降低（图6a&6b）。NF-κB是炎症反应的关键介质，调节促炎基因的诱导和抑制。NF-κB的激活被发现与炎症性疾病的进展有关。然而，转录组学分析没有显示TLR4和P65在对照组、模型组和PEPH组中的表达有显著变化。这种差异可能是由于样本采集的时间造成的。基因水平和蛋白质水平的表达时间可能存在差异。此外，细胞中积累的高蛋白水平可能会降低基因的转录。总体而言，蛋白质水平的发现验证并补充了转录谱的变化，强调了PEP-1对上皮黏液层的有益作用及其对NF-κB通路的抑制作用。这些结果有助于我们更好地理解PEP-1如何促进黏膜健康和减轻炎症。
图6 NF-κB通路和紧密连接基因的蛋白表达水平。TLR4、P65、Ocln（a，b）和ZO-1（c）的相对蛋白表达。
5. 血清代谢物、基因表达变化与生化指标的相关性分析
为了揭示血清代谢物、基因表达变化和生化指标之间的关系，我们进行了Spearman秩相关分析。我们使用聚类相关性热图（图7a和7b）显示了分析结果，该热图直观地表示了三个因素之间的相关性。值得注意的是，紧密连接蛋白，特别是Ocln，与结肠长度和IL-10呈正相关，与脾脏指数、DAI和促炎细胞因子呈负相关。相比之下，炎症因子、趋化因子和NF-κB通路成分的基因表达以及血清代谢物表现出相反的趋势：它们与结肠长度和IL-10呈负相关，但与其他生化指标呈正相关。在血清代谢产物中，黄嘌呤与生化指标的相关性最强。血清代谢物与基因表达变化的相关性分析表明，所有血清代谢物与紧密连接呈负相关，与炎症因子、趋化因子和NF-κB通路呈正相关。这些相关性结果表明，通过血清代谢组学分析鉴定的差异血清代谢物可以促进炎症因子的表达，激活NF-κB通路，加剧结肠炎症，损害肠屏障功能。PEP-1的干预与这些代谢物的下调有关，有助于缓解小鼠的慢性结肠炎症状。识别不同的血清代谢物及其影响途径对于理解疾病进展和确定潜在的治疗靶点至关重要。相关性分析加强了代谢组学改变和分子水平变化之间的一致性，为PEP-1对结肠炎影响的机制提供了进一步的见解。
图7（a）Spearman生化参数与血清代谢物和基因表达变化的相关性热图；（b）Spearman血清代谢物与基因表达变化相关性热图。显著相关性以*p
结论
近年来，饮食治疗因其健康和经济特性而受到越来越多的关注。本研究的结果部分证明了余甘子果胶多糖在血清代谢组学和转录谱方面对DSS诱导的结肠炎小鼠模型的缓解作用。研究结果表明，PEP-1给药导致血清代谢组发生显著变化，特别是与鞘脂代谢、嘌呤代谢以及亚精胺和精胺生物合成相关的途径。相关性分析表明，代谢组学变化与转录组学揭示的分子水平变化一致。PEP-1降低炎症因子、结直肠癌癌症启动子和NF-κB的表达，并促进紧密连接水平，这与黏膜屏障功能直接相关。这些结果通过蛋白质表达分析得到了证实。总的来说，这项研究支持了PEP-1可以作为治疗结肠炎的有益饮食成分的观点，突出了其对代谢和炎症途径的多方面影响。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813024095667#f0035
来源：老尹的科学大讲堂
