摘要：尽管过渡金属氢化物配合物可催化不饱和官能团（如：羰基、烯烃和炔烃）的多种转化反应，但以过渡金属氢化物为特征的天然金属酶却很少。如图1a所示，[NiFe]和[FeFe]氢化酶可催化金属氢化物对氢分子的异裂，但目前还尚未报道过在天然金属酶中由金属氢化物均裂引发的不
尽管过渡金属氢化物配合物可催化不饱和官能团（如：羰基、烯烃和炔烃）的多种转化反应，但以过渡金属氢化物为特征的天然金属酶却很少。如图1a所示，[NiFe]和[FeFe]氢化酶可催化金属氢化物对氢分子的异裂，但目前还尚未报道过在天然金属酶中由金属氢化物均裂引发的不对称自由基途径（图1b）。另一方面，第一排过渡金属（如：Fe、Co、Mn）在均相催化中已被用于原位生成金属氢化物，从而催化未活化烯烃的加氢官能团化。这些反应通常由氢原子转移引发的自由基过程进行，统称为金属-氢化物氢原子转移（MHAT）反应（图1c），并成功应用于全合成和复杂分子的后期官能团化。然而，由于氢原子转移时形成的前手性有机自由基物种的短暂性及其与对映纯催化剂之间的弱相互作用，因此要想在均相催化中实现不对称MHAT仍颇具挑战。相比之下，酶能够以优异的立体选择性（包括不对称自由基反应）催化高难度的转化反应，而且酶内结构良好的二级配位层对于导向短寿命自由基中间体的对映体识别至关重要。
近日，瑞士巴塞尔大学的Thomas R. Ward教授课题组对细胞色素P450酶（CYPs）进行定向进化，获得可催化不对称MHAT自由基环化反应的金属酶（即MHATase），成功实现了未活化烯烃和其它自由基受体（如：腙、肟、腈）的不对称MHAT自由基环化反应，并以高对映选择性（高达98:2 er）获得了一系列环状化合物（包括吡咯烷、哌啶、茚满和四氢化萘）。机理研究证实了具有催化活性的P450-FeIII-H通过MHAT与未活化末端烯烃发生反应，然后进行分子内自由基加成，从而得到对映体富集的环化产物（图1d）。相关成果发表在Nature 上。
图1. 涉及金属氢化物的催化反应。图片来源：Nature
首先，作者选择前手性二烯1为底物、苯基硅烷（PhSiH3）为氢源对反应条件进行优化（图2a），具体而言：在P450BM3X-射线晶体结构的指导下对远端Fe-卟啉半球的13个氨基酸位置进行定向进化（图2b），结果显示在三轮饱和诱变后得到的三重突变体P450BM3_F87L-A74Q-I263Q（P450BM3_LQQ）能以44%的产率和6：94 e.r.值得到吡咯烷2（图2c）；若1与P450BM3_LQQ在10 °C进行反应，对映选择性会更高（e.r.值 4：96），但总产率较低。为了进一步提高酶活性，作者优化了各种反应参数，并得到最佳反应条件：即二烯1在PhSiH3为氢源、纯化的P450BM3_LQQ为催化剂、TPGS-750-M为添加剂、KPi为缓冲液的条件下进行反应时，能以94%的产率和6：94 e.r.值获得吡咯烷2（图2d）。值得一提的是，携带P450BM3_LQQ的大肠杆菌全细胞也能有效地催化二烯1的不对称反应且效率相当（产率91%，e.r.值 6:94），特别是使用全细胞将生物催化剂负载量降低至0.1 mol%也能以59%的产率（相当于TON=590）和6:94 e.r.值得到吡咯烷2。另外，利用振动圆二色谱，作者将吡咯烷主要对映体的绝对构型确定为(S)-2。
图2. 活性MHATase的发现及定向进化。图片来源：Nature
在最优条件下，作者使用0.1 mol%全细胞催化剂探索了二烯的底物适用性（图3），结果显示一系列带有给/吸电子基团的芳基磺酰基（2-5）、甲磺酰基（6）、苯甲酰基（7）、酯基（8、9、10）、酮羰基（11、12）、氰基（13）、酰胺（14）和膦酸酯（15）取代的二烯甚至多种延伸二烯（16-18）均能兼容该反应，以良好的产率和对映选择性得到相应的环化产物，尽管甲磺酰基（6）和苯甲酰基（7）取代的二烯进行反应时需要对催化剂进行重新定向进化。值得一提的是，用更缺电子的富马酸酯取代丙烯酸酯自由基受体时能以良好的产率和对映选择性（7:93 e.r.，508 TON）生成γ-内酰胺12，而先前的Fe(acac)3/PhSiH3体系则以低产率（
图3. Giese反应的底物范围。图片来源：Nature
其次，作者还探索了MHATase催化其它自由基受体（包括腙、肟和腈）的不对称环化反应（图4），研究表明在P450BM3_F87V-A74Q-I263Q（P450BM3_VQQ）的存在下，苯甲酰腙取代的二烯能以优异的对映选择性（2:98 e.r.，TON高达325）得到相应的吡咯烷（26-28），同时乙酰腙（29）或易去除的氨基甲酸酯（30、31）取代的二烯也具有良好至优异的对映选择性。此外，MHATase催化的腙环化反应还能以良好至优异的对映选择性得到六元环骨架（即哌啶32和四氢化萘33）。值得一提的是，肟和腈底物也能顺利生成相应的吡咯烷（34、35）和吡咯烷酮（37），这可能通过一锅法MHAT自由基环化/亚胺水解实现。
图4. 自由基受体的MHATase催化底物范围。图片来源：Nature
为了进一步探究反应机理，作者进行了一系列实验，具体而言：1）UV-Vis光谱研究表明P450BM3_LQQ与PhSiH3混合后可以产生P450-FeII，后者没有催化活性；2）氘标记实验表明硅烷是参与氢原子转移的氢源，而水则是最终质子化步骤的质子源（图5a）；3）环丙基底物40在标准条件下进行反应时仅检测到环戊烷衍生物41（图5b），这说明该反应是由氢原子转移到末端烯烃引发的，并产生自由基Int-42，引发环丙烷环的均裂并产生一级自由基Int-43，其随后进行分子内Giese加成便可得到环戊烷41。在此基础上，作者提出了MHATase催化自由基环化反应的可能机理（图5c）。首先，P450-FeIII与PhSiH3 进行反应生成具有催化活性的P450-FeIII-H，其可以沿两个反应模式进行：a）在生产模式中，P450-FeIII-H通过MHAT过程与二烯1的未活化末端烯烃进行反应，然后进行分子内（Giese）自由基加成，随后与水结合的P450-FeII复合物发生协同质子耦合电子转移便可得到对映体富集的吡咯烷2；b）在非循环模式中，P450-FeIII-H均裂分解生成P450-FeII和氢分子，这种非循环亚铁物种很容易被空气重新氧化并得到具有催化活性的三价铁P450-FeIII。值得注意的是，进化后的MHATase在（Giese）自由基加成步骤中实现了显著的立体控制，展示了其在对映决定步骤中的重要作用。
图5. 机理研究。图片来源：Nature
如图6a所示，当200 mg二烯1在标准条件下进行反应时，以81%的分离产率（165 mg）和7:93 e.r.值获得 (S)-吡咯烷2，进一步展现出该反应的规模化前景。最后，作者尝试通过MHATase催化的自由基环化反应来获得 (R)-对映体，初步研究显示表达CYP119_WT的大肠杆菌全细胞能以64:36 e.r.值形成 (R)-吡咯烷2，而双突变体CYP119_D77R-T214V则能以71:29 e.r.值和418 TON获得 (R)-2且催化剂负载量低至0.1 mol%。随后，作者在CYP119_WT晶体结构的指导下对血红素周围的10个氨基酸进行迭代饱和突变（图6b），在四轮定向进化后得到了包含七个突变体的变体G4（CYP119_G4），其能以85:15 e.r.值和305 TON合成 (R)-2（图6c）。类似地，苯基和酯基上带有不同取代基的底物也能以中等至良好的产率和对映选择性获得相应产物（3-5、8、44）。
图6. 放大反应及获得相反的吡咯烷对映体。图片来源：Nature
总结
Thomas R. Ward教授课题组对细胞色素P450酶（CYPs）进行定向进化，获得可催化不对称MHAT自由基环化反应的金属酶，成功实现了未活化烯烃和其它自由基受体（如：腙、肟、腈）的不对称MHAT自由基环化反应，并以高对映选择性（高达98:2 er）获得了一系列环状化合物。毫无疑问，这项研究为绿色合成和生物催化领域的发展开辟了新方向，同时展示了生物催化在未来化学合成中的广阔前景。
Repurposing haemoproteins for asymmetric metal-catalysed H atom transfer
Xiang Zhang, Dongping Chen, María Álvarez, Thomas R. Ward
Nature, 2025, 644, 381-390, DOI: 10.1038/s41586-025-09308-0
来源：X一MOL资讯