摘要：2025年7月，来自意大利Humanitas研究医院和Humanitas大学的Salvatore Piscuoglio团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol for the establishment and characteriza

2025年7月，来自意大利Humanitas研究医院和Humanitas大学的Salvatore Piscuoglio团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids from surgical resection without the use of Matrigel》的研究文章，提出了一种无需基质胶即可扩增和维持肺源性类器官的方案。

文章介绍

#1

摘要

摘要

类器官对研究癌症发病机制和治疗耐药性非常重要，但它们的生长通常要依靠价格昂贵、从动物身上提取的基质胶。

在本文中，研究者提供了一种不需要基质胶就能培养和维持肺源类器官的实验方案。本文介绍了如何建立肺癌类器官、如何对类器官进行免疫组化染色，以及如何用ClinoStar（一种专用培养设备）来培养它们。

这种方案不再依赖基质胶，也省去了相关的成本，能让更多人有条件开展类器官研究，还能扩大研究规模，从而让基于类器官的研究在癌症研究和疗法开发中更容易推进。

#2

研究思路

Methods

这份实验方案详细说明了如何从手术切除的组织中培养出肺肿瘤类器官，以及如何在不使用细胞外基质成分的情况下，将它们在培养环境中维持10-12天。整个方案包含三个主要步骤：

1. 在静态培养系统中，利用手术获取的组织样本培育出肺肿瘤类器官；

2. 将培养的类器官进行扩增，并转移到ClinoReactor中，整个过程无需使用基质胶；

3. 通过免疫组化染色的方法对培育出的肿瘤类器官进行特征分析，并与标准培养系统的结果做对比；

#3

实验设计

design

下图是实验方案的示意图

一. 准备工作

试剂和耗材清单见“实验仪器和材料”。

6孔板需提前在37℃培养箱中预热12-15 h。

浓缩型基质胶需在实验前一天于4℃条件下解冻。

所有离心步骤（若无特殊说明）均在4℃下进行。

除石蜡包埋外，所有步骤都必须在生物安全柜中进行，以保持无菌。

需要提前配制并经0.22 μm滤膜过滤灭菌的培养基，包括：

a. 组织培养基；

b. 含抗生素的基础adDMEM/F12培养基；

c. 含抗生素的基础DMEM培养基；

d. 含抗生素的DPBS；

e. 终止培养基；

f. 解离培养基；

g. 肺类器官专用培养基；

h. 冻存培养基。

二. 从手术切除组织建立肺肿瘤类器官，耗时：4-5 h

1. 将组织收集到含有组织培养基的50 mL 离心管中，可在当天或次日于4℃下处理（未观察到质量下降）。注意：除非另有说明，所有操作均应在冰上进行。

2. 将组织转移到100 mm培养皿中，用冷DPBS+++清洗以减少污染。

a. 在冷DPBS+++中孵育10 min。

b. 弃去DPBS，并重复清洗三次。关键：清洗过程中不要让组织干燥。

3. 将“干净”的肿瘤组织分成三份（图1A）。

a. 固定/组织学分析。

b. 类器官建立/慢冻保存。

c. SNAP冻存。关键：如果手术样本过小（

图1

4. 原发肿瘤的固定/组织学处理（18-21℃）。

a. 切取0.5×0.5 cm的组织块。

b. 用塑料镊子转移至组织学盒。

c. 将组织盒置于8%福尔马林中，18-21℃固定12 h。

d. 进行小活检程序处理，石蜡包埋，常温保存。暂停点：组织可在18-21℃暂存，等待进一步处理。

5. 使用手术刀或剪刀将剩余组织切碎（图1B）。

6. 如果组织量足够，可将少部分保存为慢冻样本，用于未来解离。

7. 慢冻样本处理。

a. 向冻存管中加入1 mL冷冻保存液。

b. 每管加入少量切碎组织。

c. 尽快将冻存管置于降温盒中，-80℃冻存15-20 h。

d. 次日转入液氮长期保存。

8. 将切碎的组织放入5 mL消化液中，置于15 mL离心管。

9. 将离心管放入转子中，在37℃下以20 rpm旋转40-60 min。注意：每 15 min在显微镜下检查一次，观察单个细胞释放的增加情况。

10. 按1:1比例加入停止液终止消化，并将混合液转入50 mL离心管。

11. 用冷DPBS+++补至30 mL。

12. 通过100 μm滤网过滤到新的离心管中。关键：用5 mL注射器的柱塞压下滤网上的残余组织（滤网需先用冷DPBS+++冲洗），以帮助过滤。

13. 用20 mL冷DPBS+++清洗滤网，倾斜滤网并收集流下的溶液，然后弃去滤网。

14. 在4℃下400 g离心5 min。注意：所有离心步骤均4℃下进行，除非另有说明。关键：若组织脂肪或坏死严重，先以200 g离心5 min，弃去上清液中的杂质。

15. 小心吸去上清，避免触碰沉淀。

16. 如果沉淀呈红色（说明含有红细胞），加入 1 mL 红细胞裂解液（1×）（图2）。

图2

17. 室温孵育3 min。

18. 加入DPBS补至40 mL终止反应。

19. 以300 g离心5 min。

20. 弃去上清，将沉淀重悬于10 mL DPBS+++中并冲洗。

21. 再次以300 g离心5 min。

22. 去除上清，将沉淀重悬于1 mL advDMEM/F12+++（体积可根据沉淀大小调整）。

23. 取10 μL台盼蓝溶液+ 10 μL细胞悬液混合，在血球计数板下人工计数。

24. 将整个细胞悬液以300 g离心5min。

25. 去除上清。

26. 将离心管置于冰上，根据需要体积用基质胶重悬沉淀。注意：推荐接种量为10万细胞/20 μL基质胶小滴（每孔10-12滴）。关键：基质胶18-21℃下会迅速凝固，因此在接种前需全程保持在冰上。

27. 从培养箱中取出预热好的培养板。

28. 在18-21℃下，将20 μL基质胶小滴接种到培养板中。

29. 1-2 min后倒置培养板，转入37℃培养箱。

30. 静置20 min，使基质胶完全凝固。

31. 加入2 mL相应的类器官培养基。注意：类器官的形成与生长平均需要约2周（不同患者会有差异）（图3）。

图3

三. 将肺肿瘤类器官从静态小滴转移至无基质胶悬浮培养，耗时：2-3 h

为了确保成功，建议每位患者都保留平行的dome（小滴）静态培养，以防悬浮培养失败。传代操作应在类器官完全形成、并且小滴长满时进行（图4A）。

另外，为了提高无基质胶培养的成功率，建议起始材料至少为6孔板中2个孔的小滴（总共大约20-24个小滴）。

图4

32. 前一天将所需数量的基质胶小份放入冰箱解冻。

33. 移除需要传代的类器官孔中的培养基。注意：如果同一培养条件下有多个孔，可以将最多2个长满的孔合并处理。

34. 每孔加入1000 μL冷DPBS+++。

35. 用细胞刮刀轻轻刮下所有小滴。

36. 将各孔合并到一个15 mL离心管中，置于冰上。

37. 用 500 μL冷DPBS+++ 再冲洗一次所有已收集类器官的孔，并将15 mL离心管补足至10 mL。

38. 以400 g、4℃离心5 min。

39. 去除上清。

40. 每孔加入1000 μL TrypLE Express，充分吹打以打散沉淀。

41. 在37℃水浴中孵育3 min，并在显微镜下观察（可将离心管略倾斜以便在显微镜下观察）。关键：重复此步骤，直到类器官被打散为单细胞或小细胞团，但总孵育时间不得超过20 min。注意：在光学显微镜下确认是否获得单细胞。

42. 加入等体积的冷停止液终止TrypLE 反应。

43. 加入冷DPBS+++补足至10 mL。

44. 将细胞悬液通过40 μm滤网（去除未完全解离的大类器官）过滤到50 mL离心管中。

45. 用5 mL冷DPBS+++冲洗滤网。

46. 将滤液转移至15 mL离心管。

47. 以300 g、4℃离心5 min。

48. 去除上清。

49. 再以300 g、4℃离心5 min。

50. 将沉淀重悬于500 μL冷advDMEM/F12+++中。

51. 使用血球计数板计数细胞。注意：在此步骤中，细胞总量将被分为两份：一份用于重新接种到基质胶小滴中（参考步骤25-30，图4C）。另一份包含约1.5-2×10⁶个细胞，将直接接种到ClinoReactor中（ClinoReactor 10004-12，CelVivo公司），并按照厂家说明做适当调整（图4B）。

52. 按厂家说明对ClinoReactor进行水化和平衡。

53. 通过顶端口移除ClinoReactor中的培养基。

54. 向反应腔室加入5 mL预热的肺类器官培养基。

55. 通过样品口将1.5-2×10⁶个细胞注入已平衡的ClinoReactor。

56. 缓慢补充培养基，不要扰动细胞。注意：将针头贴着ClinoReactor的前或后壁注入，可以分散流速，使加液更温和。

57. 继续加液，直到腔室略微溢满。

58. 轻轻敲击ClinoReactor，去除培养腔内的气泡。

59. 重新盖上顶塞，并用移液器吸去多余培养基。

60. 轻轻旋转培养腔，检查是否仍有残留气泡。

61. 将ClinoReactor放入ClinoStar，在37℃、5% CO₂下孵育，初始转速为5-10 rpm。注意：转速应根据不同类器官系进行优化，并随着类器官体积增加而每日逐步调整，以保持它们在稳定轨道中悬浮。

62. 建议首次更换培养基的时间为72 h后。在10-12天后，这些患者来源类器官（PDO）可以用于后续实验（如药物筛选、分子特征分析、免疫组化染色），或再次解离并重新接种到新的ClinoReactor中以扩增。

四. 类器官的组织学分析，耗时：约3天

63. 类器官固定。

a. 移除需要传代的类器官孔中的培养基。i. 如果同一培养条件下有多个孔，可以合并最多2个长满的孔。

b. 每孔加入1000 μL冷DPBS+++：i. 用细胞刮刀轻轻刮下所有小滴。ii. 将各孔合并至15 mL离心管中，置于冰上。

c. 用500 μL DPBS+++再冲洗一次所有已收集类器官的孔。

d. 以400 g、4℃离心5 min。

e. 去除上清。

f. 加入等体积的Cell Recovery Solution以溶解基质胶（每孔约1 mL），不会破坏类器官结构。

g. 冰上放置20 min，在中途轻轻吹打帮助基质胶溶解。

h. 加入冷DPBS补足至10 mL。

i. 以300 g、4℃ 离心5 min。关键：若仍有残留基质胶，需要重复步骤64-68后再继续。

j. 去除上清，将沉淀重悬于1 mL 8% 甲醛（需在通风橱内操作）。注意：若当天进行固定，室温（18-21℃）放置1 h即可。或者可置于4℃固定24 h。

k. 固定完成后，以300 g、4℃离心5 min。i. 去除上清，用1 mL DPBS 重悬沉淀。注意：在石蜡包埋前，样品可在4℃保存，最长1周。

64. 类器官石蜡包埋：注意：所有步骤需在通风橱内进行。

a. 将固定后的类器官以300 g离心5 min。

b. 去除DPBS/甲醛（取决于前一步固定条件），用70 μL Histogel重悬沉淀。注意：Histogel 储存于4℃，需用微波炉加热至融化，冷却后会快速凝固，使用前需再次加热。最佳用量为70 μL，根据沉淀大小调整，但不得少于50 μL或多于100 μL。关键：为防止Histogel快速凝固，可将带有沉淀的离心管先浸在温水中，再直接在温水中用Histogel重悬（图5A）。

c. 将Histogel-类器官混合液滴加在石蜡膜卷背面，室温干燥40 min（图5B-C）。

d. 将形成的小胶块放入包埋盒（图 5D）。

e. 将包埋盒放入包埋机中处理12 h。

图5

65. 免疫组化染色（IHC）。

a. 将石蜡包埋的类器官切成3 μm 薄片，贴于带正电荷的载玻片上。

b. 脱蜡：i. 二甲苯10 minii. 二甲苯10 miniii. 无水乙醇1 miniv. 无水乙醇1 minv. 90%乙醇1 minvi. 70%乙醇1 minvii. 置于蒸馏水中保存

c. 抗原修复：将切片置于Tris-EDTA 缓冲液（pH9）中，98℃水浴20 min。

d. 室温下在Tris-EDTA缓冲液中冷却。

e. 转移到PBS+0.05% Tween溶液中。

f. 室温下在PBS+0.05% Tween+2% H₂O₂中孵育20 min。

g. PBS+0.05% Tween清洗。

h. 加入Background Sniper阻断非特异性结合，室温孵育15 min。

i. 加入稀释好的一抗（PBS+0.05% Tween配制），室温孵育1 h。

j. 在PBS+0.05% Tween中清洗两次，每次5 min。

k. 加入MACH 1 Mouse probe，室温孵育15 min（仅限小鼠单克隆抗体）。

l. PBS+0.05% Tween清洗5 min。

m. 加入HRP-Polymer，室温孵育30 min（针对每种一抗）。

n. PBS+0.05% Tween清洗两次，每次5 min。

o. 在切片上加入DAB显色液（DAB Chromogen 1滴/1 mL DAB Substrate Buffer），显微镜下观察显色。

p. 当信号达到所需强度时，用自来水终止反应。注意：DAB显色时间通常不超过1 min。

q. 用苏木素复染细胞核（30 s-1 min）。

r. 用自来水冲洗，直至水清澈。

s. 依次脱水：i. 70%乙醇30 s；ii. 90%乙醇30 s；iii. 无水乙醇30 s；iv. 无水乙醇30 s；v. 二甲苯5 min；vi. 二甲苯5 min；t. 用Eukitt封片剂封片。

u. 在20×和40×显微镜下拍摄图像，比较类器官与原始肿瘤组织的形态特征（图6）。

图6

五. 预期结果

本研究方案证明了可以从切除的肺组织中成功建立患者来源类器官，这一模型能够为研究肺发育、疾病进展以及个体化治疗反应提供有力工具。

本研究中验证了两种非小细胞肺癌的病理类型（腺癌与鳞癌），作为可通过该方法评估的典型实例。值得注意的是，本研究中肺类器官在悬浮系统中培养和扩增，无需依赖基质胶，这带来了多重优势。

基质胶由于其成分不确定且来源于动物，可能引入实验差异；将其从培养体系中去除，不仅简化了操作流程、降低了成本，还提升了模型的临床相关性。

虽然悬浮培养下的类器官形态与传统静态滴状培养有所不同（图4），但两种方式均保持了类器官对原始组织的特异性。免疫组化实验验证了这一点：悬浮培养的类器官在肺腺癌标志物TFF-1与肺鳞癌标志物p40的表达上，均与其原始组织相符（图6）。

这些结果表明，悬浮培养不仅能够实现肺类器官的规模化和更高标准化扩增，同时也能保留其关键生物学特征。

六. 实验仪器和材料

七. 局限性

该方法的主要局限之一在于对ClinoStar仪器及其相关技术的依赖性，这可能会限制其普及。此外，由于类器官属于原代细胞培养，其建立和长期维持的效率具有一定的变异性，成功率在很大程度上取决于患者个体差异及原始组织样本的质量。尤其是坏死比例较高的肿瘤样本，其类器官形成成功率显著降低。

另一个关键因素是在从静态培养过渡到动态培养时所需的细胞数量，对于ClinoStar系统来说需要约1-2×10^6个细胞，这往往意味着从手术切除样本扩增到足够细胞量可能需要较长时间。事实上，初始细胞数量不足会导致培养失败，因为类器官的存活与扩增依赖于足够的细胞-细胞相互作用。因此，确保最佳的细胞密度对于维持类器官的活性与可扩增性至关重要。

八. 问题解决

问题1：在5 mL解离液中的切碎组织漂浮或未被完全覆盖（见步骤8）。

可能的解决方案：若组织量较多，建议转移至50 mL离心管，并将解离液增加至10-15 mL，以保证组织充分浸润。

问题2：类器官在解离后未能完全分散为单细胞（见步骤41）。

可能的解决方案：可适当延长孵育时间至12-20 min，但注意不要超过20 min，以免降低细胞活力。另一种方法是补充TrypLE试剂，以增强类器官及细胞团簇的解离效果。如果20 min后仍有部分类器官未被解离，可继续后续步骤，因为这些结构会在过滤步骤中被去除。

问题3： ClinoReactor培养腔内出现气泡且无法通过在培养箱中旋转消除（见步骤 60）。

可能的解决方案：将ClinoReactor垂直放置，使气泡上浮，然后打开顶部塞子，加入少量新鲜培养基，直至液面溢出并填满接口周围的环槽，从而将气泡排出培养腔。

问题4： 在用Histogel制备类器官石蜡包埋时，凝胶穹顶表面形成气泡（见步骤65.c）。

可能的解决方案： 在凝固前，使用移液枪吸头或移液器轻轻去除气泡，以避免影响后续包埋和切片。

参考文献

Donà F, Erratico S, Terracciano LM, et al. Protocol for the establishment and characterization of lung tumoroids from surgical resection without the use of Matrigel. STAR Protoc. Published online July 2, 2025. doi:10.1016/j.xpro.2025.103923

来源：培养盒守护者