摘要：作者单位：100853 北京，中国人民解放军总医院第二医学中心保健九科，老年医学科，保健七科；100853 北京，中国人民解放军医学院研究生院
中国心血管杂志2025Chinese Journal of Cardiovascular Medicine
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姜黄素改善衰老脂肪干细胞治疗效能的
体外研究
In vitro study on the improvement of therapeutic efficacy of aging adipose-derived stem cells by curcumin
孙明研 朱平 刘剑锋 王曙霞 孙瑾 秦邦国 张楠
作者单位：100853 北京，中国人民解放军总医院第二医学中心保健九科，老年医学科，保健七科；100853 北京，中国人民解放军医学院研究生院
通信作者：朱平，电子信箱：zhuping301hospital@163.com
引用本文：
孙明研, 朱平, 刘剑锋, 等. 姜黄素改善衰老脂肪干细胞治疗效能的体外研究[J]. 中国心血管杂志, 2025, 30(3): 315-324. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5410.2025.03.013.
zhai
摘
yao
要
目的
探讨姜黄素对衰老脂肪干细胞(ADSCs)的治疗效能及相关机制。
方法
从SD大鼠腹股沟分离自体 ADSCs，检测相关蛋白表达并验证分化潜能。将ADSCs分为3组进行处理：对照组(Control组)、诱导衰老模型组(H2222组)。采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色，检测ADSCs衰老水平。流式细胞仪检测细胞凋亡，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测Caspase-3活性，采用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内活性氧( ROS)水平，JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1和p53的mRNA相关表达及蛋白表达，采用ELISA检测衰老相关分泌细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果
2222组β-gal水平、细胞凋亡率、Caspase-3浓度和ROS水平均显著降低，线粒体膜电位明显升高(均为P2222组姜黄素处理缓解了SIRT1的mRNA相关表达及蛋白表达水平下降，缓解了p53的mRNA相关表达及蛋白表达水平升高(均为P2222组衰老相关分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平均明显下降(均为P结论
姜黄素显著提高衰老ADSCs的细胞功能和治疗潜力，这与SIRT1信号通路激活相关。
脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，能够有效促进组织修复和细胞再生[1]。在个体衰老进程中，其自体ADSCs的增殖能力、分化能力和修复功能显著下降，这些变化导致衰老ADSCs的治疗潜力受到极大限制[2]。姜黄素(curcumin)作为一种天然的抗氧化、抗炎化合物，已被证实具有减轻氧化应激损伤、降低炎症反应以及延缓细胞衰老的潜在治疗作用[3]。本研究旨在通过姜黄素预处理衰老的ADSCs，探讨其对衰老ADSCs活化的具体影响，并进一步阐明其潜在的作用机制。1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂
Sprague Dawley大鼠(SD大鼠，180~250 g，雄性，6~8周龄)购自北京军事医学科学院实验动物中心，饲养7 d。在整个实验过程中，大鼠保持在22℃，12 h/12 h明暗循环，并自由使用标准颗粒饲料和水。实验步骤均符合美国国立卫生研究院(NIH)2011年公布的《实验动物饲养管理和使用指南(第8版)》，并通过中国人民解放军总医院实验动物福利伦理委员会审查批准(审查批号：IACUC-2023-0016)。姜黄素为上海源叶生物科技有限公司产品(生产日期：2023-04-03，产品批号：O21IS229303)。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶均为美国Gibco公司产品。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)染色试剂盒为上海碧云天生物技术股份有限公司产品。CD90抗体、CD31抗体、CD44抗体、CD45抗体、CD29抗体和CD34抗体均为美国Abcam公司产品。茜素红染色试剂盒、油红O染色试剂盒均为北京拉索生物科技有限公司产品。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(Caspase-3，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。凋亡检测盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)试剂盒为美国Sigma公司产品。Hoechst 33342染色液为上海源叶生物科技有限公司产品。细胞染色缓冲液为美国Biolegend公司产品。
1.2 ADSCs的分离、培养和鉴定
1.2.1 细胞分离
ADSCs分离按照本团队以往报道的方法，在无菌条件下从SD大鼠的腹股沟处获得[4]。将SD大鼠麻醉后断颈处死。在无菌条件下，取出腹股沟处脂肪组织，使用PBS洗涤并剪碎。随后加入Ⅳ型胶原酶和胰酶进行消化，并在匀速搅拌下处理1 h。经过中和、过滤、离心、弃上清和重悬等步骤后，将细胞悬液(1×106细胞/ml)接种至10 cm培养皿中，添加含10%α-MEM培养基。当细胞生长至70%~80%汇合时，进行消化并收集贴壁细胞(原代细胞，P035)。细胞贴壁培养24 h后，使用普通光学显微镜(SZ51，日本Olympus公司)观察细胞形态。1.2.2 表型鉴定
ADSCs以1×106细胞/ml的密度分装至1.5 ml的Eppendoff离心管中。使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次后，根据CD34、CD31、CD45、CD44、CD90和CD29抗体的说明书，加入适量抗体，并在37℃暗室中孵育30 min。孵育结束后，再次用细胞染色缓冲液洗涤细胞，最后每管加入1 ml细胞染色缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪(美国BD Accuri C6)进行检测。使用FlowJo软件分析数据。1.3 ADSCs的分化诱导
1.3.1 ADSCs培养及诱导成骨分化
将处于80%~90%融合度的 ADSCs 接种到培养皿中。加入成骨诱导培养基，确保细胞能够在适宜的环境中开始成骨分化。每3~4 d更换1次培养基。在成骨分化的最后，使用4%多聚甲醛对细胞进行固定。将固定后的细胞用PBS清洗。将细胞用茜素红溶液染色，通常染色30 min。使用显微镜观察细胞内是否出现矿化区域，矿化区域会呈现红色[5]，并记录观察结果。1.3.2 ADSCs培养及诱导成脂分化
将ADSCs接种到培养皿中，保持在常规培养条件下(37℃，5%CO2)。加入成脂诱导培养基。每3~4 d更换1次培养基。在21 d培养结束后，先使用4%多聚甲醛固定细胞，然后PBS清洗。固定后的细胞用油红O染料染色。成功的成脂分化会表现为细胞内出现大量红色脂肪滴[6]1.4 实验分组
分为3组：(1)对照组(Control组)：10 μM姜黄素处理ADSCs 24 h[4，7];(2)诱导ADSCs衰老模型组(H2222处理ADSCs 12 h[8];(3)姜黄素干预组(Cur- H2222处理ADSCs 12 h。1.5 衰老相关β-gal染色
将ADSCs接种到24孔板中。用PBS洗涤1次，加入4 ml β-gal染色固定液，室温固定15 min。将固定后的ADSCs与β-gal染色工作液在37℃下孵育过夜。孵育完成后，用PBS再次洗涤细胞[9]。阳性衰老细胞(显示蓝色沉积)使用显微镜进行成像。通过Image J 1.52a等软件对阳性细胞进行计数，以量化衰老细胞的比例。β-gal是一种重要的水解酶，能够催化β-半乳糖苷键的水解，常用于衰老细胞的检测。X-Gal染料是β-gal的显色底物，在β-gal的催化下，X-Gal会被水解生成一种不溶性的蓝色产物，能够在显微镜下清晰地识别出衰老细胞。
1.6 ELISA法检测Caspase-3活性
Caspase-3 是细胞凋亡的关键执行酶[10]，其活化形式是凋亡的标志性蛋白[11]。按照ELISA试剂盒说明书步骤进行。使用预包被的酶标板，每孔加入100 μl样本。每孔加入50 μl生物素化的抗Caspase-3检测抗体，37℃孵育1 h。加入酶标二抗：每孔加入50 μl辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育30 min。每孔加入100 μl显色底物(TMB)，室温避光孵育10~30 min。每次孵育后需充分洗涤，避免非特异性结合。加入显色底物(TMB)，在HRP催化下生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色。通过酶标仪在450 nm处测定OD值，OD值与Caspase-3浓度呈正比。因此，可以定量分析样本中Caspase-3的活性。1.7 细胞凋亡检测
细胞凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸会从内侧翻转到外侧，暴露在细胞膜表面。AnnexinⅤ是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，能与外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合。通过异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记AnnexinⅤ，可以在流式细胞仪上检测到绿色荧光信号，从而识别早期凋亡细胞[12]。碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但可以进入膜完整性丧失的细胞(如晚期凋亡细胞或坏死细胞)并与DNA结合，使细胞核染成红色荧光。联合使用Annexin Ⅴ-FITC和PI，可以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。细胞处理之前，使用胰酶将细胞从培养皿中消化并收集。AnnexinⅤ-FITC染色：将消化后的细胞加入5 μl AnnexinⅤ-FITC染料，室温下放置10 min;继续加入5 μl的PI染料，并在室温下孵育15 min。经过孵育和洗涤后的细胞，将通过流式细胞仪(Flow Cytometer)进行分析。应用515 nm波长检测FITC荧光，应用560 nm波长检测PI荧光，判断标准：左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。
通过流式细胞仪的荧光激发与发射检测，可以获得细胞群体中凋亡细胞的比例，计算细胞凋亡率。
1.8 细胞内活性氧含量检测
采用DCFH-DA检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成[12]。DCFH-DA是一种广泛应用于ROS检测的荧光探针。DCFH-DA本身无荧光，能够自由穿过细胞膜。进入细胞后，在细胞内酯酶的作用下，DCFH-DA的乙酸酯基团被水解，生成无荧光的DCFH，DCFH不能自由穿过细胞膜，因此被保留在细胞内。当细胞内存在ROS时，DCFH被氧化为具有绿色荧光的2′，7′-二氯荧光素(DCF)。Hoechst 33342用于染色细胞核，发出蓝色荧光。具体方法如下：细胞接种于6孔板，PBS洗涤2次。用5 μM DCFH-DA在37℃避光孵育30 min，用PBS洗涤3次。然后用Hoechst 33342进行细胞核染色，37℃避光孵育15 min，用PBS洗涤2次。最后用荧光显微镜观察，荧光染色的强度使用IPWIN60软件定量分析相对ROS水平。1.9 线粒体膜电位检测
将配好的JC-1染色工作液添加至培养基内，使工作液与细胞在37℃、避光的环境中共同孵育30 min。用PBS洗涤细胞3次，去除未结合的JC-1。接着加入DAPI对细胞核进行染色，3 min。染色完毕，将培养基更换为PBS，以此消除培养基自身颜色对后续拍照环节造成的干扰。利用荧光显微镜对细胞的红绿荧光变化情况进行观察，随机选取5个视野，在每个视野中再随机选取30个细胞，对这些细胞的红绿荧光平均比值展开测定。
1.10 实时荧光定量聚合酶链反应检测
使用TRIzol提取总RNA[13]。使用mRNA反转录试剂盒(Thermo Fisher RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，美国)将分离出的mRNA反转录cDNA，并PCR扩增。使用FastStartTM Universal SYBR Green Master (ROX)试剂盒(Roche，瑞士)和Applied BiosystemsTMStepOnePlusTMReal-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific，美国)进行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR)检测。相关mRNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)纯化(表1)。表1 实时荧光定量聚合酶链反应引物
1.11 免疫印迹法检测SIRT1信号通路和p53蛋白表达
提取待测细胞蛋白，定量后将所有蛋白样品调至等浓度，加入2×十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)凝胶加样缓冲液，煮沸5 min变性;进行SDS-PAGE，转膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)后封闭，将膜与一抗4℃孵育过夜，再与HRP标记二抗室温孵育[14]。增强的化学发光试剂检测PVDF膜上的蛋白条带，首次曝光1 min，根据显影调节蛋白条带的强弱，确定最佳的曝光时间。通过蛋白条带的平均光密度来比较蛋白表达情况。1.12 ELISA检测衰老相关分泌因子水平
利用ELISA检测试剂盒，按照说明书配制相关溶液，用酶标仪读取450 nm下各孔的OD值。根据标准品的浓度和OD值绘制标准曲线，计算各组细胞培养上清液中的白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等衰老相关分泌因子水平。
1.13 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。根据Shapiro-Wilk检验，数据服从正态分布，采用M±SD表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分
析(ANOVA)。P
2 结果
2.1 ADSCs的分化潜能与鉴定
油红O染色及茜素红染色结果证实，ADSCs具有向骨细胞、脂肪细胞分化的多能性(图1A、1B)。流式细胞术验证ADSCs的细胞表面标记物。ADSCs表面标志物，如CD90(参与细胞间和细胞-基质的相互作用)、CD44(参与细胞迁移、增殖等过程)、CD29(参与细胞与细胞外基质的相互作用)是其典型特征，而低表达或不表达CD45(造血细胞标志物)、CD31(血管内皮细胞标志物)和CD34(造血干细胞早期标志物)则有助于将其与其他细胞类型区分开来。通过检测这些标志物，可为ADSCs的进一步研究和临床应用提供重要依据。结果表明，ADSCs表现出 CD44、CD90和CD29的强阳性表达(大于95%)，CD31、CD34和CD45的阴性表达(小于10%)(图1C)。而衰老的ADSCs中CD44、CD90和CD29的阳性表达降低(图1D)。
注：ADSCs，脂肪干细胞;A.ADSCs的茜素红染色结果(红色矿化区域);B.ADSCs的油红O染色结果(红色脂肪滴);C.刚分离的ADSCs中CD44、CD90和CD29的强阳性表达(大于95%)，CD31、CD34和CD45的阴性表达(小于10%);D.衰老的ADSCs中CD44、CD90和CD29的阳性表达降低(n=3)
图1 ADSCs的分离与鉴定
2.2 姜黄素预处理降低ADSCs的衰老水平
222组显著降低(P图2。图2 β-gal染色检测ADSCs衰老水平
2.3 姜黄素预处理增加ADSCs的细胞活力，降低细胞凋亡
姜黄素预处理对衰老ADSCs有明显的保护作用。与Control组相比，H222222222222导致的ADSCs细胞凋亡率。图3 姜黄素预处理对ADSCs的细胞保护作用
2.4 姜黄素预处理减少ADSCs中ROS含量
采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平的变化。结果显示，在ADSCs 中，与Control组相比，H222222222组，表明姜黄素预处理降低了细胞内ROS水平。图4 姜黄素预处理减少ADSCs中ROS含量
2.5 姜黄素预处理保护ADSCs中线粒体膜电位
线粒体膜电位是反映线粒体内膜通透性的重要指标之一，线粒体膜电位下降主要是由于膜通透性转运孔的开放，也是细胞凋亡的早期特征之一[15]。采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强;细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。结果显示，与Control组相比，H2222组绿色荧光显著减少(P图5。2.6 qRT-PCR检测SIRT1和p53 mRNA相关表达
SIRT(sirtuin)是一种依赖NAD+的去乙酰化酶，SIRT1在细胞抗衰老中发挥积极作用[16]。p53为衰老相关基因，常作为检测细胞衰老水平的标志物[17]。采用qRT-PCR检测SIRT1和p53的mRNA相关表达。结果显示，H2222图8 ELISA法检测ADSCs上清液中衰老相关分泌细胞因子水平
3 讨论
ADSCs具备向多种细胞类型分化的能力，有效促进细胞修复与再生，但自体干细胞随着增龄出现老化，其增殖和修复能力下降[1-2]。大量研究报道，姜黄素在抗炎、抗氧化及降低氧化应激损伤等方面发挥重要作用[3]。本研究围绕姜黄素对ADSCs的治疗效能展开多方面探究，获得了一系列具有重要意义的结果。在ADSCs的分化与鉴定方面，通过成脂和成骨诱导实验以及流式细胞术，证实其具备多向分化潜能及典型的细胞表面标志物特征，是确保实验结果有效性的关键前提。
通过β-gal活性检测发现，姜黄素处理的衰老ADSCs的β-gal水平显著降低。这表明姜黄素能够有效干预ADSCs的衰老进程。姜黄素预处理对ADSCs的细胞活力及凋亡的影响同样显著。在细胞凋亡实验中，Cur-H2222导致的ADSCs的Caspase-3活性升高。这一系列结果表明，姜黄素预处理能增加ADSCs的细胞活力，减少细胞凋亡，对ADSCs起到明显的保护作用。SIRT1是干细胞功能的重要调节因子，参与氧化应激、炎症反应及抗细胞衰老等多种生理病理过程[18-19]。本研究应用qRT-PCR和Western blot方法检测SIRT1和衰老相关标志物p53的mRNA相关表达及蛋白表达，结果显示，H2222组增加p53的mRNA相关表达及蛋白表达，而姜黄素处理降低了p53的mRNA相关表达及蛋白表达水平。有研究表明，p53通路的激活在间充质干细胞衰老过程中发挥着关键作用，SIRT1能够通过去乙酰化作用抑制p53蛋白的活性[20]。本课题组前期研究证实，经姜黄素预处理的ADSCs能通过PTEN/Akt/p53信号通路抗凋亡及促血管形成增强心肌修复[4]。本研究结果表明，姜黄素预处理可能通过激活SIRT1信号通路并抑制p53活性，从而显著改善ADSCs的衰老状态。22222222引起的线粒体膜电位水平的下降。有研究报道，SIRT1在体外和体内调节ROS的产生和积累，从而减弱与神经变性相关的氧化应激[21]。本研究体外试验结果显示，姜黄素预处理的衰老ADSCs的ROS水平显著下降，与上述结果一致。既往研究认为，线粒体损伤及功能障碍引发细胞衰老主要与 ROS 代谢有关[22]。ROS和线粒体功能障碍可导致凋亡性Caspase激活，从而促进细胞凋亡[23]。线粒体膜电位下降也是细胞凋亡的早期特征之一[24]。因此，本研究结果提示，姜黄素预处理可能通过清除 ROS，降低线粒体膜通透性，改善细胞活力和降低细胞凋亡水平。衰老过程中的氧化应激被认为是导致ADSCs功能下降的主要原因之一，氧化应激反应致ADSCs炎症反应[25]。SIRT1在调节ADSCs炎症反应方面具有重要作用，尤其是在核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)通路的调控下。有研究表明，SIRT1能够通过去乙酰化NF-κB，抑制炎症反应[26]。通过SIRT1/NF-κB通路，降低心肌梗死模型中促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6等)的表达，从而缓解心脏炎症反应[27]。本研究结果显示，H22暴露后衰老相关分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平显著升高，而姜黄素处理逆转H22暴露后细胞因子水平的升高。因此，姜黄素能够通过激活SIRT1通路，从而抑制其促炎作用。综上所述，本研究通过多个实验环节证实，姜黄素预处理可有效改善衰老ADSCs的生物学特性，提高其细胞活力、降低衰老及凋亡水平。其作用机制与SIRT1信号通路密切相关。姜黄素预处理的ADSCs作为一种新兴的抗衰老策略，具有显著的安全性和临床转化潜力。与基因修饰、小分子药物和传统干细胞治疗相比，姜黄素预处理的ADSCs避免了伦理争议和非特异性效应。未来的研究应进一步探索姜黄素预处理ADSCs的分子机制，并开展更多的临床试验，以验证其在抗衰老领域的应用价值。不过，本研究仅针对SIRT1信号通路进行了研究，而姜黄素对ADSCs的影响可能不仅限于这一条通路。未来还需要通过转录组测序等技术针对姜黄素对ADSCs衰老的保护作用进行全面研究。
来源：中国心血管杂志