摘要：不可修复的损伤和内耳毛细胞的耗竭会导致永久性听力障碍。耳蜗类器官作为研究耳聋发病机制和探索治疗策略的强大体外平台，已被广泛应用。然而，目前耳蜗类器官培养中广泛使用的商业化基质胶存在一致性和结构稳定性方面的问题。
不可修复的损伤和内耳毛细胞的耗竭会导致永久性听力障碍。耳蜗类器官作为研究耳聋发病机制和探索治疗策略的强大体外平台，已被广泛应用。然而，目前耳蜗类器官培养中广泛使用的商业化基质胶存在一致性和结构稳定性方面的问题。
该研究开发了一种基于合成明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶的耳蜗类器官培养系统，该系统促进了耳蜗干细胞的自发聚集与组织化，从而加速了类器官的形成，并有助于耳蜗毛细胞的功能成熟。
还观察到在类器官自组织早期阶段，细胞外基质（ECM）发生了快速而广泛的重塑。在耳蜗类器官发育过程中，基质金属蛋白酶（MMP）显著上调，其中MMP9的表达相对较高。抑制MMP会显著干扰类器官的形成过程，这表明它们在耳蜗类器官形态发生中具有重要作用。
综上所述，该研究为耳蜗类器官的生成提供了一种替代方法，并强调了MMP介导的细胞外基质重塑在类器官形成过程中的贡献。
文章介绍
题目：建立用于重塑细胞外基质的人工耳蜗类器官平台
杂志：ACS Nano
影响因子：16.0
发表时间：2025年7月
#1
研究背景
Background
耳蜗被包裹在人体最致密的骨骼中，这种致密的骨结构也使得在人体上进行活检极具挑战性。建立有效的体外模型对于研究内耳发育及相关疾病至关重要。
目前已有多种已发表的方法可用于利用诱导多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）或少量组织特异性驻留干细胞/祖细胞生成内耳类器官。在这些方案中，自我组装与分化是类器官形成过程中的两个重要因素。研究人员通过改变培养条件来提高耳蜗类器官中突触形成的效率，从而进一步促进了其成熟。
目前，耳蜗类器官的培养基质依赖于基质胶，但它批次间差异性且可能影响免疫系统。为耳蜗类器官培养提供所需化学与物理信号引导的人工生态位环境还较少被开发。
本研究介绍了一种基于GelMA水凝胶的培养系统，用于耳蜗类器官的形成。从机制上讲，GelMA水凝胶通过MMP，尤其是MMP9介导的ECM重塑，促进了耳蜗类器官的自组装。
总之，该研究为建立耳蜗类器官提供了一种高效、稳定且简便的培养方法（图1），克服了传统基于基质胶培养体系的局限性，进一步揭示了在水凝胶培养体系中耳蜗器官发生的潜在机制。
图1
#2
研究关键点
Key points
1. 建立和优化GelMA水凝胶培养体系：稳定性与生物相容性测试；最佳浓度确定；
2. 研究GelMA水凝胶对耳蜗类器官形成和增殖的影响：细胞聚集与增殖能力评估、转录组分析、关键基因与通路分析；
3. 验证GelMA水凝胶在耳蜗类器官功能成熟和毛细胞分化中的作用：毛细胞分化与成熟评估、功能性测试、神经元-毛细胞突触形成。
#3
研究结果
Results
该研究开发了一种GelMA水凝胶系统，以构建一种比基质胶更可控的合成三维培养基质。扫描电子显微镜评估三种浓度（5%、7.5%和10%）的GelMA水凝胶以及基质胶的孔隙结构（图2b）。不同浓度的GelMA水凝胶之间在电导率方面未观察到显著差异。5%GelMA水凝胶表现出最高的稳定性，并与基质胶具有高度相似性。不同浓度的水凝胶对耳蜗干细胞活力没有影响，表明GelMA具有良好的生物相容性。
图2
为确定用于耳蜗器官发生的最佳GelMA水凝胶浓度，将出生后第1-1.5天（P1-P1.5）小鼠分离的耳蜗干细胞嵌入商业化基质胶及不同浓度的GelMA水凝胶中。在增殖至第5天时，在基质胶和GelMA水凝胶中，耳蜗干细胞均已扩增形成球形类器官（图3b）。
与基质胶中形成的类器官相比，GelMA水凝胶中形成的类器官面积显著更大，其中在5%GelMA中培养的类器官显示出最大的尺寸。
图3
进一步评估增殖能力，5%GelMA中的增殖细胞数量高于基质胶中的增殖细胞数量，但在基质胶与7.5%或10%GelMA之间未观察到显著差异（图3d）。这些结果表明，5%GelMA能有效促进耳蜗类器官的增殖，因此用于后续实验。
图3
与基质胶培养体系中的细胞相比，GelMA水凝胶中的耳蜗干细胞自组织速度明显更快。在GelMA中，经过48 h的聚集出现了轮廓清晰的耳蜗类器官形态，其直径可达200 μm（图4b）。
第1、3和5天时两个体系中的类器官均随时间逐渐增大，但GelMA生成的类器官始终且显著大于基质胶中的类器官。
图4
为了评估耳蜗类器官在GelMA中随时间的增殖情况，采用针对不同细胞周期阶段特异性标记物对增殖细胞进行标记：PH3（标记G2期/分裂期）、EdU（指示DNA合成期）以及Ki67（活跃进入细胞周期）。
从第1天起，类器官在GelMA中表现出强劲的增殖活性，并持续至聚集后的第5天（图4e）。到第5天时，GelMA中EdU阳性细胞和PH3阳性细胞的比例显著高于基质胶。
在这一阶段，每个类器官中Ki67阳性细胞的百分比在GelMA中也明显高于基质胶。这些结果表明，GelMA中较高的细胞密度促进了耳蜗干细胞的快速聚集，同时增强了类器官的增殖能力。
图4
RNA测序检测基质胶和GelMA中培养细胞之间的转录组差异以阐明GelMA介导的耳蜗类器官形态发生增强的机制。
实验重复组之间具有高度的表达模式相似性。在基质胶和GelMA培养的类器官中，分别有2161个和3088个基因为各自独有表达，两组之间有1445个差异表达基因（其中1043个上调，402个下调）。
基因本体分析揭示了GelMA在细胞因子产生、细胞黏附、ECM组织、组织重塑及器官再生中的调控作用。关键的分子功能富集包括与ECM的相互作用、整合素介导的生长因子结合以及黏附分子活性，提示其在细胞-ECM互作中的作用。
细胞组分分析显示，有丝分裂纺锤体和与ECM相关的条目出现富集。在GelMA培养的类器官中，ECM重塑相关基因呈现上调表达。GelMA培养体系中MMP2、MMP9、MMP19、Col6a4和Col6a6的表达升高。这些结果表明，GelMA水凝胶可能通过调控ECM重塑过程，促进耳蜗类器官的形成。
为探究GelMA是否通过ECM重塑促进耳蜗类器官扩增，在无生长因子培养基（不含EGF、IGF和β-FGF）中培养类器官。基质胶和GelMA培养的类器官尺寸均有所减小，但GelMA培养的类器官仍大于基质胶组。
EdU/Ki67染色显示GelMA类器官中增殖细胞比例更高（补充图3b），这表明GelMA介导的增强型细胞间相互作用可在不依赖外源性生长因子信号的情况下维持增殖活性。即便在不含生长因子的GelMA培养条件下，关键ECM重塑基因的表达水平仍然升高。
这些结果表明，即使在水凝胶无生长因子培养条件下，GelMA也能够通过ECM重塑等过程形成细胞间接触，从而进一步促进细胞增殖。
补充图3
为进一步阐明耳蜗类器官在GelMA水凝胶培养体系中的扩增机制，对在基质胶和GelMA中培养5天的类器官进行RNA测序分析。GO富集分析显示，与Wnt信号通路、干细胞增殖、器官生长、内耳发育以及ECM重塑相关的通路显著上调。
GO分析显示，在GelMA培养的类器官中，与耳蜗干细胞特性相关的重要基因表达上调，这些基因包括Lgr5、Lgr4、Shh、Axin2、Cdh1、Myc和Lin28b。
免疫荧光染色显示耳蜗干细胞标志物——Lgr5、Hmga2和Fst表达均有所增强，证实了GelMA能够促进耳蜗类器官的生长与扩增。此外，GelMA培养的类器官中ECM重塑相关因子MMP9表达上调，胶原蛋白（Col4a3、Col4a4和Col4a5）水平升高（图6f-h）。
GelMA中的细胞排列相较于基质胶更显无序，但这种排列模式与体内小鼠耳蜗的发育动态相一致（图6i–k）。这表明GelMA提供了一种动态微环境，不仅能够模拟自然耳蜗生长过程，同时还能促进干细胞的增殖。
图6
在培养基中添加了广谱MMP抑制剂GM6001，持续5天。与对照组相比，GM6001处理导致GelMA中形成的耳蜗类器官数量更少、体积更小。连续5天的实时活细胞成像证实，添加GM6001抑制了耳蜗干细胞的聚集。
MMP9的蛋白水平在GelMA培养体系中也显著升高（图7d）。GM6001处理有效抑制了类器官的形成，并消除了MMP9的表达（图7f）。
图7
为明确MMP9在耳蜗类器官形成中的作用，将MMP9 shRNA包装进腺相关病毒AAV中——该血清型被优化用于耳蜗干细胞的转导。新生野生型小鼠（P0）通过内耳注射接受了AAV。注射后48 h解剖内耳组织，将其解离为单细胞，并在GelMA水凝胶中培养5天。
到第7天时，表达MMP9 shRNA的耳蜗干细胞形成了显著更小的类器官。实时活细胞成像证实，MMP9的敲低显著抑制了干细胞在GelMA中的聚集。这些结果表明，MMP酶活性对于耳蜗祖细胞在GelMA中的自组装是必需的，而MMP9可能是其中一个潜在的贡献因子。
为探究在GelMA中培养的耳蜗类器官是否能重现体内毛细胞的发育过程，将耳蜗干细胞分别于基质胶或GelMA中培养5天，随后进行分化诱导。第10天收获的类器官被用于评估毛细胞分化效率。
在GelMA培养体系中，与离子通道活性、膜电位调控、静纤毛束形成以及内耳感受器细胞分化相关的通路显著富集。关键的毛细胞分化基因、膜电位调节因子和突触成熟标志物在GelMA中表达上调，表明其促进了毛细胞的加速成熟。
与基质胶相比，GelMA类器官中GFP（标记早期毛细胞）荧光更强（图8f），并且每个球体中Atoh1-GFP⁺细胞的比例更高，还产生了更多的Myosin7a⁺毛细胞。
染色证实GelMA中耳蜗外毛细胞（OHC）分化增强（图8g），而内毛细胞（IHC）的能力更优（图8h）。毛细胞成熟标志物以及Atoh1、Otof、Pou4f3、Myo7a和Prestin表达在GelMA类器官中也显著升高（图8i）。
图8
为确定类器官中再生毛细胞的来源，利用Sox9-CreERT2:Rosa26-CAG-LSL-tdTomato小鼠进行谱系追踪，进行他莫昔芬注射追踪毛细胞转分化过程。
在GelMA和基质胶中培养的耳蜗类器官里，Sox9-tdTomato与Myosin7a共定位，且Sox2与Myosin7a合并表达（图8n）。GelMA组中约80%的Myosin7a⁺细胞为Sox9-tdTomato双阳性，Sox2-tdTomato/Myosin7a双阳性细胞的比例达到了约80%，均高于基质胶组。
这表明GelMA能够提供一个仿生的微环境，从而提高分化效率并促进类器官成熟。
图8
为评估GelMA水凝胶中耳蜗毛细胞的功能性成熟状态，针对突触前带状标记物Ctbp2进行了免疫荧光染色。与基质胶相比，在GelMA中培养的类器官其毛细胞内的突触前囊泡密度更高，GelMA类器官中的纤毛束更加突出且排列有序（图9a-b）。
随后评估培养第30天类器官的功能成熟度。GelMA培养体系中毛细胞的静息膜电位与体内P3期耳蜗毛细胞相当。GelMA来源的毛细胞在去极化刺激下还能产生动作电位，这是功能成熟的标志性特征。GelMA类器官中外向整流钾电流强度超过P3期天然IHC，表明其离子通道活性增强。相较于天然P3期毛细胞，GelMA类器官中快慢速钾电流成分均显著放大。
图9
在分化条件下将螺旋神经节神经元（SGN）与耳蜗干细胞进行共培养。与无法将SGN整合进类器官的基质胶不同，GelMA能够使SGN融入耳蜗类器官中。这些SGN与毛细胞的基底部表面建立了直接接触（补充图7b）。突触后蛋白PSD95与Myosin7a+的毛细胞存在共定位现象，标志着功能性神经元-毛细胞突触的形成（补充图7c），从而重现了体内毛细胞与SGN之间的相互作用。
这些结果表明，GelMA具有重建耳蜗微环境的能力，为研究耳蜗发育、毛细胞再生以及神经元-上皮细胞间的相互作用提供了一个具有生理相关性的平台。
补充图7
小结
该研究发现，精准调控水凝胶浓度可有效促进耳蜗类器官的成熟。机制研究表明，在GelMA水凝胶培养体系中，类器官形成存在关键的自组装过程，这使得通过小分子干预实现靶向控制成为可能。
这一方法学上的进步为生成多细胞、具有功能的耳蜗类器官以及构建内耳病理模型搭建了一个可靠的平台，从而填补了再生医学和转化听觉研究中的关键空白。
参考文献
Li N, Zhang Z, Zhang L, Wu D, Li Z, Xu C, Sun Q, Lu Y, Zhou Y, Qian X, Hu Y, Tan F, Qi J, Chai R. Establishment of a Cochlear Organoid Platform for Remodeling the Extracellular Matrix. ACS Nano. 2025 Jul 29;19(29):26542-26561. doi: 10.1021/acsnano.5c04897.
来源：培养盒守护者