深层过滤是生物下游工艺中常用的澄清技术,其应用场景包括但不限于细胞收获液的澄清过滤,low pH孵育后料液的深层过滤以及ADC中去除小分子杂质的深层过滤。一般来说单级深层过滤器的回收率能达到90%以上。但是在实际应用中会出现一些收率低的场景。那么引起深层过滤收率低的原因有哪些?如何解决收率低的问题?本文将分享深层过滤低回收率的原因和解决方案。默克www.sigmaaldrich.cn提供各类生命科学解决方案和服务。摘要:深层过滤是生物下游工艺中常用的澄清技术,其应用场景包括但不限于细胞收获液的澄清过滤,low pH孵育后料液的深层过滤以及ADC中去除小分子杂质的深层过滤。一般来说单级深层过滤器的回收率能达到90%以上。但是在实际应用中会出现一些收率低的场景。那么引起深层过滤收
回收策略不当
利用深层过滤器过滤完料液后,为了充分回收料液会采用回收措施以提高收率。通常使用缓冲液冲洗或气吹的方式进行产品回收。当缓冲液冲洗体积过少或者气吹方式不得当就会造成回收率损失。一般建议缓冲液冲洗不低于2倍系统死体积或5psi压力气吹方式减少缓冲液冲洗体积。
在实际应用中即使回收策略得当也会出现一些收率低的场景。下面我们将逐一进行讨论分析。
深层过滤器载量过低
在初期做深层过滤小试载量测试时,一般会测试深层过滤器的最大载量,收率一般能达到90%以上。如前所述,为了提高收率,通常使用缓冲液冲洗或气吹的方式进行产品回收。但是由于深层过滤器内部存在滞留体积,会存在一定体积的料液在深层过滤器膜包中无法有效回收。放大时,如果料液体积过少或由于滤器尺寸限制直接使用过大的膜面积可能会导致放大载量远低于小试推荐的载量,当上样载量过低时,无法回收的料液体积占比更大,从而影响收率计算。这种情况建议适当提高深层过滤器的载量或者降低膜面积提高收率。本文将分享两个实际案例。
案例一:细胞收获液的深层过滤
某CHO细胞收获液经过小试深层过滤器选型和载量测试,在不低于50L/m2载量下放大收率可达92%。在放大过程中,由于实际收获料液体积减少最终上样载量20L/m2进行放大,结果收率只有30%。采用相同的回收措施(系统两倍死体积缓冲液冲洗),载量调整为原建议载量后,收率恢复正常。
案例二:low pH孵育后料液的深层过滤
某单抗项目经亲和层析纯化和低pH孵育后的深层过滤澄清步骤未经过小试优化直接使用库存滤器规格放大,9L收获液利用0.55m2膜包(膜包死体积5L)进行过滤,载量16L/m2,3倍死体积的缓冲液进行冲洗回收后收率仅有80%。小规模试验重新确定载量后,将载量提高到170L/m2,改为540cm2规格的滤器进行过滤,回收率达到95%。
目的蛋白与深层过滤器
发生电荷/疏水相互作用
深层过滤器一般由基质(纤维素/聚丙烯酸纤维,具有疏水区域),助滤剂(硅藻土或硅胶,带负电)以及树脂粘合剂(带正电)组成。有些目的蛋白在一定的缓冲液条件下容易与深层过滤器发生电荷/疏水相互作用,从而影响收率。由电荷吸附/疏水相互作用带来的回收率问题一般可以在小试深层过滤器选型阶段避免,通过选择合适的深层过滤器或者调整缓冲液的pH/电导率进行冲洗和回收,降低电荷吸附/疏水相互作用带来的收率问题。
在滤器选择上,可根据具体产品特性和工艺需求参考表1和图1进行选择。
表1 默克深层过滤器材质及应用参考
*非CHO细胞培养料液请联系默克技术工程师进行深层过滤器选型
图1 默克深层过滤器孔径分布图对于细胞收获液的收获澄清,默克经典的D0HC/X0HC滤器与抗体或者工艺相关杂质发生相互作用主要基于疏水相互作用;而对于下游low pH的深层过滤,Millistak+® HC X0HC与蛋白结合主要基于混合模式(疏水和静电)相互作用;Millistak+® HC pro与蛋白结合主要是基于静电相互作用。
案例三:
某单抗等电点7,亲和层析和低pH孵育步骤后利用深层过滤器过滤降低浊度并去除HCP等杂质。使用pH 7.5, 电导率4ms/cm的Tris缓冲液。测试三种深层滤器A1HC, X0HC和X0SP,三种滤器的载量表现为A1HC~X0HCX0HC (92%)>X0SP (88%),HCP去除效果A1HCpI,蛋白带负电,且电导率较低,因此容易与带正电的深层过滤器发生相互作用。不同深层过滤器带电性和疏水性不同,与蛋白发生相互作用的程度不同。因此在选择深层过滤器时,需要综合考虑深层滤器与蛋白之间的相互作用,回收率和杂质去除需求选择合适的深层过滤器。
细胞收获液中高固含量影响回收率计算
对于高固含量的料液,在细胞收获液澄清步骤计算回收率时需要考虑细胞固含量的影响。由于细胞属于固体,如果被计入料液体积,而在过滤过程中细胞会被拦截,最后得到的料液体积会低于初始包含细胞的料液体积。以固含量6%-10%的细胞收获液为例,在计算回收率时,如果没有考虑细胞的占比,那么收率会低6%-10%,造成收率偏低的假象。
综上所述,利用深层过滤器进行澄清时,首先要根据工艺要求选择回收策略。上样载量过低,蛋白与深层滤器间的静电/疏水相互作用也会对回收率产生影响。此外,计算回收率时忽略固含量的影响也可能造成回收率低的假象。建议在深层滤器选型和工艺放大时,尽量避免这些因素带来的影响,减少这一步骤的收率损失。图2 深层过滤低回收率参考原因及解决方案参考文献
[1] Novel synthetic adsorptive depth filter media for CHO harvest clarification. Merck poster
[2] Comparison of host cell protein removal by depth filters with diatomaceous earth and synthetic silica filter aids using model proteins. Biotechnology Bioengineering. 2023; 120: 1882-1890.
[3] Control of antibody high and low molecular weight species by depth filtration‐based cell culture harvesting. Biotechnology and Bioengineering. 2019;116: 2610–2620.
来源:不能胖胖胖