摘要：CCK - 8(Cell Counting Kit - 8)实验是一种基于WST - 8(2 - (2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基) - 3 - (4 - 硝基苯基) - 5 - (2,4 - 二磺酸苯) - 2H - 四唑单钠盐)的比色法细胞活性检测技
一、实验原理
CCK - 8(Cell Counting Kit - 8)实验是一种基于WST - 8(2 - (2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基) - 3 - (4 - 硝基苯基) - 5 - (2,4 - 二磺酸苯) - 2H - 四唑单钠盐)的比色法细胞活性检测技术。WST - 8在电子载体1 - 甲氧基 - 5 - 甲基吩嗪𬭩硫酸二甲酯(1 - Methoxy PMS)的催化下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜量与活细胞的数量和活性成正比，在450 nm波长处有最大吸收峰，通过检测吸光度值即可间接反映细胞的存活和增殖情况，进而评估细胞的毒性。
二、实验材料与试剂
细胞：待检测的贴壁或悬浮细胞系。培养基：适合细胞生长的常规培养基，如DMEM、RPMI 1640等，添加适量的胎牛血清(FBS)。CCK - 8试剂：一般由商业公司提供，按照说明书要求保存和使用。胰蛋白酶：用于贴壁细胞的消化传代。96孔细胞培养板：用于细胞接种和培养。CO₂培养箱：提供细胞生长的适宜环境(37℃、5% CO₂)。酶标仪：用于检测450 nm波长处的吸光度值。三、实验步骤
(一)细胞接种
将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化(贴壁细胞)或直接收集(悬浮细胞)，然后用含血清的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。用血球计数板或细胞计数仪对细胞悬液进行计数，根据实验需求将细胞悬液稀释至合适的浓度，一般每孔接种细胞数量为3000 - 10000个(可根据细胞生长速度和实验目的调整)。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，设置适当的对照孔(如空白对照、阴性对照、阳性对照)，然后将培养板放入CO₂培养箱中培养24 h，使细胞贴壁(贴壁细胞)或适应培养环境(悬浮细胞)。(二)药物处理(可选)
如果研究药物对细胞的毒性作用，在细胞培养24 h后，弃去原培养基，加入含有不同浓度药物的新鲜培养基，每孔100 μL，每个浓度设置多个复孔(一般3 - 6个)，继续培养一定时间(根据药物作用特点，一般为24 h、48 h或72 h)。(三)CCK - 8试剂加入
在培养结束后，轻轻吸取每孔中的培养基(不要吸净，避免吸走细胞)，然后每孔加入10 μL CCK - 8试剂，轻轻振荡培养板，使试剂与细胞充分混匀。将培养板放回CO₂培养箱中继续孵育1 - 4 h(具体孵育时间根据细胞类型和活性调整，一般在1 - 2 h内吸光度值会达到稳定，可通过预实验确定最佳孵育时间)。(四)吸光度值检测
孵育结束后，将培养板从培养箱中取出，轻轻振荡几下，使溶液均匀。用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度值(OD值)，同时可以检测600 nm或其他波长作为参比波长，以校正背景吸收。四、实验结果计算与分析
细胞活力计算：细胞活力(%)=(实验组OD值 - 空白对照OD值)/(阴性对照OD值 - 空白对照OD值)× 100%。其中，空白对照孔不接种细胞，只加入培养基和CCK - 8试剂;阴性对照孔接种正常细胞，加入不含药物的培养基和CCK - 8试剂;实验组孔接种细胞并加入不同浓度的药物和CCK - 8试剂。细胞毒性分析：根据细胞活力计算结果，绘制细胞活力随药物浓度或处理时间变化的曲线。通常以药物浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标，通过曲线可以直观地观察到药物对细胞的毒性作用，计算半数抑制浓度(IC₅₀)，即细胞活力抑制50%时的药物浓度，IC₅₀值越小，说明药物的细胞毒性越强。五、实验注意事项
细胞状态：确保细胞处于对数生长期，细胞状态良好，接种细胞时要保证细胞悬液均匀，避免细胞团聚。试剂使用：CCK - 8试剂应现用现配，避免长时间放置导致试剂失效。加入CCK - 8试剂时要轻轻振荡培养板，使试剂与细胞充分接触，但避免产生气泡，以免影响吸光度值检测。培养条件：整个实验过程中要保持培养环境的稳定，CO₂培养箱的温度、湿度和CO₂浓度要符合细胞生长的要求。对照设置：合理设置对照孔，包括空白对照、阴性对照和阳性对照，以便准确分析实验结果。检测时间：CCK - 8试剂孵育时间要适当，过长可能导致吸光度值过高，超出酶标仪的检测范围;过短则可能导致吸光度值过低，影响检测的灵敏度。可通过预实验确定最佳孵育时间。六、应用领域
药物研发：评估药物对细胞的毒性作用，筛选具有潜在治疗作用且毒性较低的药物，确定药物的安全剂量范围。细胞毒性研究：研究化学物质、生物材料等对细胞的毒性影响，为相关产品的安全性和有效性评价提供依据。细胞生物学研究：观察细胞在各种处理条件下的生长和存活情况，研究细胞的增殖、凋亡等生物学过程。隆科生物合作项目
分子生物学实验：荧光定量PCR检测、Western blot检测、血常规、生化酶活、ELISA检测等。细胞实验：耐药细胞株构建、细胞毒性实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验、细胞流式周期检测、细胞流式凋亡检测等。动物实验：动物模型构建、动物饲养服务、动物临床前研究、药效评价、功能性评价等。微生物学实验：抑菌试验、药敏试验、菌种鉴定、微生物多态性分析等实验。病理检测：石蜡包埋、切片、HE染色、masson染色、番红固绿染色、天狼星红染色、免疫组化、免疫荧光单标/双标/多标、全景扫描、激光共聚焦拍照等。来源：隆科生物
