摘要：脊髓损伤作为一种毁灭性的中枢神经系统疾病，急性机械力引起的完全性脊髓损伤（SCI）往往导致永久性的运动和感觉功能障碍，给患者带来毁灭性的影响，给社会带来沉重的经济负担。其修复难题在于中枢神经系统再生能力微弱，损伤后神经纤维难再生长连接，炎症反应又进一步阻碍修复

滨州医学院闫欢欢教授：具有高效ROS清除、抗炎作用的导电取向纳米纤维毡，实现加速脊髓损伤修复

脊髓损伤作为一种毁灭性的中枢神经系统疾病，急性机械力引起的完全性脊髓损伤（SCI）往往导致永久性的运动和感觉功能障碍，给患者带来毁灭性的影响，给社会带来沉重的经济负担。其修复难题在于中枢神经系统再生能力微弱，损伤后神经纤维难再生长连接，炎症反应又进一步阻碍修复进程。随着人口老龄化及意外事故增加，发病率上升，迫切需有效治疗策略。

近日，滨州医学院闫欢欢教授团队在期刊《Bioactive Materials》上，发表了最新研究成果“Bioinspired conductive oriented nanofiber felt with efficient ROS clearance and anti-inflammation for inducing M2 macrophage polarization and accelerating spinal cord injury repair”。研究者通过加成聚合和静电纺丝技术，制备出构建了具有高效 ROS 清除、抗炎作用和加速神经再生的导电导向纳米纤维毡，用于脊髓损伤修复。

通过SEM、热稳定性、电活性和导电性筛选

图1：纳米纤维毡的制备和表征。a-g）不同AT含量聚合物的纳米纤维毡的SEM图像a）、频率分布b）、风玫瑰图（每个叶片表示相应角度范围内的纳米纤维数量）c）、DSC曲线d）、TGA曲线和Td e）、循环伏安曲线f）和电导率g）；h）聚合物和纳米纤维毡的水接触角和水滴在5分钟内的变化；i-j）C、O、N、S和Fe的EDX元素图（i）和PAT10的元素含量CFe@PAT j）；k）PAT10的紫外-可见光谱，CFe@PAT以及DCFe@PAT.；m）ICP法测定1g中掺杂Fe3+和AT的Fe3+含量和物量比CFe@PAT。

通过逐步加成聚合和静电纺丝技术制备FCFe@PAT纳米纤维毡。然后，通过静电纺丝制备了不同AT含量的PAT纳米纤维毡。通过SEM对纳米纤维毡的微观结构进行了研究，结果表明PAT10的纳米纤维毡具有定向、光滑和均匀的结构（图1a）。相比之下，PAT15和PAT20的结构是无序、粗糙和不均匀的，因为它们在HFIP中的溶解能力差，导致静电纺丝能力差。此外， PAT10组表现出良好的热稳定性、导电性和亲水性，CSA掺杂后PAT10导电率明显增加。因此，为了保持纳米纤维毡的有序结构并具有优异的物理和化学性能，选择PAT10纳米纤维毡掺杂CSA、FeCl3和DOPA进行后续实验，以达到最佳使用效果。

图2：不同纳米纤维毡的表征。a） 机械性能；b） 循环伏安曲线和氧化还原峰；c） d）DPPH和ABTS清除机制的棒模型；e-g）纳米纤维毡对DPPH e）、ABTS f）和H2O2 g）的清除率；h） 红细胞图像和溶血率；i） 包含图像和凝血指数（BCI）的凝血结果；j） 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率；k） 菌落照片和破碎的金黄色葡萄球菌（黄色）和大肠杆菌（紫色）的SEM图像，以及血液成分与毛毡相互作用的SEM图像*p

DCFe@PAT 纳米纤维毡在脊髓损伤修复方面性能卓越。机械性能上，PAT10 的断裂伸长率出色，满足 SCI 修复要求。电活性层面，其 CV 曲线有两对氧化还原峰，亲水性也因多种机制作用而良好，能促进 NSCs 粘附与渗出物吸收。值得注意的是，DCFe@PAT抗氧化能力突出，这是因为 CSA、Fe³⁺掺杂及 PDA 协同作用，对 ROS 和 RNS ，有高效清除作用。抗菌活性方面， PAT10 可破坏细菌结构，掺杂后的 CFe@PAT 抗菌显著增强，DCFe@PAT 因多种协同作用抑菌率较高，能有效预防 SCI 修复时的细菌感染。凝血止血上，DCFe@PAT 凝血指数低，多孔结构与相关成分利于血小板等聚集，止血机制多元高效。以上综合理化性能使其在 SCI 修复领域极具应用潜力。

图3：a-e）纳米纤维毡凝血a）、非溶血b）、抗菌活性c）、抗炎d）和促进神经干细胞分化机制e）的示意图(FCFe@PAT)。

图4：纳米纤维毡对Raw 264.7巨噬细胞的体外免疫调节特性。a-c）LPS刺激巨噬细胞后，细胞上清液中NO的产生以及TNF-α、IL-6、IL-4和IL-10的表达水平；d） DCFH-DA（绿色）/DAPI（蓝色）荧光染色评估细胞内ROS清除性能e）； f）使用流式细胞术通过DCFH-DA（ROS，FITC-A）、CD86（M1，PE）、CD206（M2，PE），IL-4（M2，FITC-A）和F4/80（M0，PE）的表达来评估巨噬细胞的ROS含量分析和极化；g-j）流式细胞术分析中DCF+、CD86、CD206和F4/80/IL-4细胞百分比的定量统计*p

DCFH-DA 探针用于评估不同纳米纤维毡对 RAW 264.7 细胞内抗氧化性能的影响。PCL 组细胞内 ROS 含量高，荧光信号强，而 PAT 组荧光强度因 CSA/Fe³⁺掺杂有所降低，DCFe@PAT 组荧光强度最低，其 Fe³⁺-PDA-PAT 螯合物抗氧化性能优异，能完全清除 ROS，流式细胞术结果也证实了其高 ROS 清除率，可减少巨噬细胞内 ROS 产生并防止细胞损伤。炎症方面，巨噬细胞分为 M1 促炎和 M2抑炎表型。RAW 264.7 细胞在LPS刺激下经不同纳米纤维毡处理后，DCFe@PAT 组 NO 水平显著降低， M1 巨噬细胞标志物基因 TNF-α 和 IL-6 表达显著降低，同时显著升高 M2 巨噬细胞标志物基因 IL-10 和 IL-4 表达，这表明其因 PDA 存在，具有出色的抗炎能力，既能抑制 M1 巨噬细胞活化，又能促进 M1 向 M2 巨噬细胞极化，对 SCI 后因炎症导致的胶质瘢痕形成等问题有着积极的改善作用，为 SCI 修复提供了有力支持。

图5：纳米纤维毡上NSCs分化的评估。a-b）在分化培养基中培养NSCs 7天后，对神经元（Tuj-1）、星形胶质细胞（GFAP）、F-肌动蛋白（鬼笔环肽）和细胞核（DAPI）进行免疫荧光染色。显示了每组在200（比例尺=100μm）放大倍数下的特征图像；c） Tuj-1、GFAP和F-actin平均荧光强度的定量统计；d） 在Tuj阳性神经元中检测到的神经突起生长长度。Tuj-1和GFAP的mRNA表达水平e）和蛋白质水平检测的蛋白质印迹f）持续7天。GAPDH用作内部对照；g） 使用ImageJ软件对Tuj-1和GFAP与GAPDH之间的蛋白质表达水平进行定量分析*p

CSA/Fe³⁺掺杂与 PDA 涂层处理对神经干细胞有显著影响。免疫染色显示FCFe@PAT 组增加了 Tuj - 1⁺神经元与 F - actin 比例，降低 GFAP⁺星形胶质细胞比例，效果最优，且神经突起生长长度增加。蛋白质印迹和qRT - PCR 结果也证实其能上调神经元基因表达、下调星形胶质细胞基因表达。这表明 FCFe@PAT 可有效诱导神经发生并抑制 NSCs 星形胶质细胞分化，原因在于其电导率、适宜的亲水性及 SDF - 1α 和 NGF 的作用。

图6：纳米纤维毡对脊髓损伤模型电生理恢复和运动功能改善的促进作用。a） 脊髓横断和纳米纤维毡移植的外科手术；1-4：T7-T10脊髓区暴露；5：T9-T10脊髓横断（3mm）；6：将纳米纤维毡移植到横断部位。（7-8）外科缝合；b） 术后8周，不同组大鼠倾斜网格攀爬（1-5）和脊髓样本（6）的图像。1-5代表对照组，PCL、PAT10的纳米纤维毡，CFe@PAT以及FCFe@PAT分别；c）在8周的治疗期间，不同组后肢的BBB评分d）；e）在网格爬行实验中，大鼠后肢在水平网格上移动100步时所走的步数；f-g）不同组的振幅和MEP曲线；h） 大鼠脊髓损伤不同阶段运动功能恢复示意图*p

以 SD 大鼠 T9 - T10 脊髓完全横断模型评估纳米纤维毡体内疗效，将不同组纳米纤维毡移植于脊髓断端。组织修复上，FCFe@PAT 组空腔与瘢痕最少、再生组织最多。后肢运动功能恢复方面，术后大鼠均瘫痪，PAT10 组较对照组和 PCL 组有恢复，CFe@PAT 组 8 周时爪子着地，FCFe@PAT 组各时间点 BBB 评分最高。IPT、平面与倾斜网格攀爬试验中，FCFe@PAT 组表现优，如 IPT 最大角度 46.3 ± 2.4°、步数 74 ± 6.1。电生理测试显示，FCFe@PAT 组 MEP 振幅接近假手术组。总之，FCFe@PAT 纳米纤维毡可抑制瘢痕再生、促进运动信号传导，降低神经元损伤风险，助力运动功能恢复，为 SCI 治疗提供依据。

图7：脊髓损伤8周后的神经再生调节和炎症反应。a） HE和Masson染色图像。绿色（HE）和黄色（Masson）箭头代表新的胶原组织，红色箭头代表再生血管；b） 巢蛋白（绿色）、Tuj-1（绿色）/GFAP（红色）、MBP（绿色）/NF200（红色），CD163（绿色）/CD68（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。虚线分隔的脊髓横截面积；c） 巢蛋白、Tuj-1、GFAP、MBP、NF200、CD68和CD163平均荧光强度的定量统计*p

在脊髓损伤修复研究中，于损伤后 4 周和 8 周利用 HE 和 Masson 染色评估 SCI 部位炎症情况。FCFe@PAT 组效果尤为显著，受损区域脊髓腔面积缩小、炎症减轻、血管与胶原增多，表明其可促脊髓组织再生。对于神经回路重建基础的 NSCs 迁移与神经元再生评估中， FCFe@PAT 组巢蛋白荧光强度更高。FCFe@PAT 组因多种作用增强了Tuj1 阳性神经元分化，抑制星形胶质细胞再生。再通过 MBP 和 NF200 免疫染色评估轴突髓鞘形成与神经纤维再生。FCFe@PAT 组损伤处有丰富再生神经纤维且髓鞘连续包裹，进一步证实纳米纤维毡移植可显著促进横断脊髓损伤神经修复，也为后续开发更有效的治疗策略奠定了基础。

图8：抗氧化机制DCFe@PAT-treatedLPS诱导炎症。a） 火山图显示了质谱结果中DEP的上调或下调。b） 热图分析表明，LPS和LPS之间存在82个DEPDCFe@PAT；c）DEP的KEGG富集分析的气泡图；x和y轴分别表示富集比和KEGG项；d） DEP的部分GO分析。x和y轴表示基因和GO项的数量。BP、CC和MF代表生物过程、细胞组成和分子功能；e） 丰富了GO-BP分析的和弦图；f） DEP的GSEA分析。g） DEP的PPI网络分析。最低互动要求分数：0.700；h） 不同处理的RAW264.7细胞中p65、P-p65、IκBα和P-IκBβ的蛋白质印迹分析。

通过对在各种纳米纤维毡上培养的 RAW 264.7 细胞进行蛋白质组学分析以阐明 DCFe@PAT 的免疫调节机制。结果显示，不同组间蛋白质存在差异，DCFe@PAT 组有特定数量的差异表达蛋白质（DEP），显著下调 CD36、IL1β 和 NFκB2 蛋白表达，上调 COX5A 蛋白表达。GO 富集分析表明其涉及多种炎症相关生物过程、细胞成分及分子功能，KEGG 通路富集揭示其通过影响炎症相关途径起作用，如氧化磷酸化等。弦图筛选出关键差异表达蛋白 IL1β 和 CD36 参与免疫调节，GSEA 结果证实其参与细胞活化调节免疫反应与巨噬细胞极化有关。PPI 网络图显示相关蛋白质分布在线粒体中，表明影响线粒体功能。此外，DCFe@PAT 抑制 NF - κB 信号通路相关蛋白，PAT 和 CFe@PAT 组也有一定作用。总之，蛋白质组学分析表明掺杂的 PAT 和 PDA 涂层可共同调节相关蛋白表达，下调 NFκB2 - κB 信号通路和 IL1β 蛋白表达，上调 COX5A，消除氧化应激，促进 M2 巨噬细胞极化，从而抑制炎症损伤，为深入理解其免疫调节机制提供依据，也为相关疾病治疗策略开发提供参考。

图9：不同蛋白质活性位点（NFκB2、TNF-α、IL-10、IL-6、COX5A、NGF、EGFR、MAPK3、SCL6A4和ADRA1）与DHI a）以及AT b）之间相互作用的模拟3D和2D模型。

基于DA-SCI和AT-SCI-PPI基因相互作用网络结果，进行分子对接，以可视化PDA/AT与五种神经相关蛋白（包括NGF、EGFR、MAPK3、SCL6A4和ADORA1）之间相互作用的结合模型和亲和力（图9和S16，支持信息）。由AT、邻苯二酚、多巴胺醌和DHI组成的配体在活性口袋周围与上述五种蛋白质受体的氨基酸残基形成多种结合力，包括范德华力、常规氢键、氢氢键、碳氢键、π-烷基、π-阴离子、π-阳离子、π-π积累和盐桥。进一步证实，导电AT和邻苯二酚DCFe@PAT通过靶向神经相关蛋白，在介导神经细胞的增殖和分化、神经元活动和神经递质的传递中起着关键作用，从而促进神经再生。

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人物简介：

闫欢欢，滨州医学院教授，硕士生导师。山东省高校青创团队带头人，毕业于中国科学技术大学，获理学博士学位。现任中医临床药学分会理事，山东省青年医务工作者协会药物药理学分会委员。主要从事生物医用高分子材料的制备及其在组织工程中的应用等研究工作。主持山东省自然科学基金1项，山东省高等学校青创团队计划项目1项，滨州医学院“口腔医学+X”院校融合创新项目1项，滨州医学院科研启动基金1项。以第一作者或通讯作者在国际权威期刊发表SCI论文十余篇，授权发明专利4项。

来源：老高说科学