摘要：2024年12月，南加州大学科研团队在期刊Nature Protocols（IF:13.1）上发表了一篇题为“Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripo

文章介绍

2024年12月，南加州大学科研团队在期刊Nature Protocols（IF:13.1）上发表了一篇题为“Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripotent stem cells”（利用多能干细胞生成并长期培养人类小脑类器官 ）的文章。

上期回顾请点击：【Nature Protocols】系列：从多能干细胞中生成并长期培养人类小脑类器官（上）

今天小学社将为大家详细讲解本研究中实验操作的20项具体步骤。

实验步骤

制备 EB

时间 1-2 小时（第 0 天）

1. 在一个涂有 Geltrex 的 60 mm培养皿中培养无饲养细胞的 hPSC，直至该培养皿达到 70-80% 的汇合度。整个培养皿将用于开始分化。通常情况下，一个汇合板可用于播种约3个96孔板。

◆ 故障排除

▲关键步骤：干细胞集落的正确形态对成功分化至关重要。因此，确保集落没有任何分化迹象（图2a）。

2. 取hPSC，在分化开始前 1 小时将培养基换成新鲜的2ml mTeSR 培养基。

3. 去除mTeSR培养基并加入2ml 1×PBS 冲洗hPS细胞板。

4. 旋转平板数次后，移去 1×PBS 并向平板中加入2ml酶使细胞解离，然后根据平板的汇合度和细胞集落的密度，将平板放入37°C培养箱中培养3-5分钟。

▲关键步骤：细胞上的琼脂糖酶不要超过7分钟，否则会对细胞造成损伤，并且不能产生良好的分化起始EB。

5. 用至少4ml DMEM-F12终止消化，转移到15ml锥形管中，将细胞团块搅拌约10次，使其分解成单细胞悬浮液。

6. 用10μl台盼蓝与10μl DMEM-F12 悬浮液中的细胞按1:1的比例混合，在血细胞计数器上计数活细胞。同时，在室温下用200g离心机离心5分钟。

7. 从细胞团中去除上清液，将细胞团重悬在1ml DMEM-F12 中。制备96孔v型底板，每孔6000个细胞（每孔100 μl），将重悬细胞团中的60万个细胞转移到装有10ml gfCDM+i培养基的15ml锥形管中，培养基中含有10μM TFG-βi、1.7μM CHIR、50ng/ml Noggin和20μM ROCKi。

8. 将细胞悬浮液倒入储液器中，用P200多通道移液器在96孔v型底板的每孔中加入100μl。将这些类器官置于37°C、5%CO2的组织培养箱中。24小时后，在显微镜下观察到边界清晰的小EB。

▲关键步骤：EB周围可能有少量死细胞，但如果细胞死亡过多，则必须终止分化。

培养EB和启动胚层分化

时间 4 d（第 2-4 天）

9. 第2天：制备含10μM TGF-βi、1.7μM CHIR、150ng/ml Noggin和20μM ROCKi的gfCDM+i。在不干扰孔底细胞的情况下，从每个孔中取出40μl培养基，然后加入50μl新鲜制备的gfCDM+i。

◆排除故障

10. 第4天：制备含10μM TGF-βi、1.7μM CHIR、100ng/ml Noggin和200ng/ml FGF8b的gfCDM+i。从每个孔中取出40μl培养基，然后加入50μl新鲜制备的gfCDM+i。

诱导峡部组织区

时间 11 d（第 6-14 天）

11. 第6天：制备含有10μM TGF-βi、1.7μM CHIR、100ng/ml Noggin和100ng/ml FGF8b的CerDM1。从每个孔中取出40μl培养基，然后加入50μl新鲜制备的CerDM1。

12. 第8天：制备双倍体积的CerDM1，其中含有10μM TGF-βi、1.7μM CHIR、100ng/ml Noggin和400ng/ml FGF8b。从每孔取出40μl培养基，加入100μl新鲜制备的CerDM1，使每孔总体积达到150μl。

◆排除故障

▲关键步骤：从第6天到第8天，将FGF8b的浓度从100ng/ml提高到300ng/ml至关重要，具体方法是在每个孔中加入新的400ng/ml FGF8b，以抵消96孔板中已有的100ng/ml FGF8b。

13. 第10天：重复步骤12，但这次去掉80μl培养基，加入100μl含有300ng/ml FGF8b而不是400ng/ml FGF8b的新鲜制备的CerDM1。TGF-βi、CHIR和Noggin的添加浓度均与步骤 12 相同。

14. 第12天：简单地更换一半培养基，移去70μl培养基，换上75μl不含任何药物或形态因子的CerDM1。

◆排除故障

15. 第14天：重复步骤14中第12天的操作，更换一半培养基。在此阶段，您可能会注意到类器官边缘有一些细胞碎片，这时您可以进行 “清洗步骤 ”以尽可能多地清除碎片。具体方法是上下移动孔中的培养基，扰乱颗粒，然后移除培养基，换上新鲜的CerDM1。

◆排除故障

摇动培养扩增的神经上皮芽

时间 13 d（第 16-28 天）

16.分化第16天，将96孔V底板中的类器官均匀移入两个10cm的培养皿中。

•准备无菌剪刀，将打开的剪刀喷洒用70%的乙醇，然后放在培养罩中晾干。然后将200 μl的移液头边缘切割成宽口径的移液头。

•将类器官转移到一个10cm的平板中，平板中含有96孔V型底平板中1/5的旧培养基（3 ml）和4/5的CerDM2培养基（12 ml）（使平板中的总培养基量达到15ml）

▲关键步骤：不要将超过半个96孔板的类器官（48个类器官）加入到一个10cm的培养皿中，否则可能会影响类器官的整体健康。

17. 在37°C和 5% CO2培养箱内的抗二氧化碳轨道摇床上培养类器官。将摇床设置为70rpm。

▲关键步骤：确保在培养箱内使用用于组织培养的低速，抗二氧化碳振动器。标准的轨道摇床可能会过热并受潮损坏。

18. 通过移除10cm板内的培养基，每3天更换一次新鲜的15ml CerDM2。

◆排除故障

小脑组织的生长和成熟

多个月的时间安排（第 30 天至 8 个月）

19. 从第30天起，每3天更换一次培养基，方法是移除10cm平板内的培养基，换上新的15ml CerDM3。培养前必须立即在CerDM3中添加0.5 ng/ml的T3，从第60天开始，还必须添加14 ng/ml的BDNF。

•如果您打算在类器官内形成分层组织，则应在第30到60天的培养基中直接加入100 ng/ml的SDF1a和1:100稀释（1%）的生长因子还原Matrigel溶液。在没有SDF1a和生长因子还原Matrigel的情况下，仍会产生所有感兴趣的细胞类型。在第60天之前，除了在进行全培养基更换时添加T3外，每隔3天在10cm平板中添加一次这些成分，以获得有组织的分层

▲关键步骤：在您打算使用培养基的当天用Matrigel、T3、SDF1a或BDNF补充CerDM3。

◆排除故障

20. 从第30天开始，可以对类器官进行各种处理，以便在不同的时间点进行分析。这些方法包括冷冻切片和对类器官进行免疫染色（选项 A）、解离成单细胞悬浮液以进一步分析单细胞分辨率（选项 B）、钙成像（选项 C）或对整个类器官进行膜片钳记录（选项 D）。

选项 A

冷冻切片和类器官免疫染色

时间 2-3 d

▲关键：如果希望进行全类器官染色，则需将一抗和二抗在旋转器上4°C下的孵育时间增加到48小时，并增加额外的清洗步骤。详见参考文献 12。

(i) 用剪下的200μl吸头将类器官移入1.5 ml锥形管中（如果类器官超过60d，则用1,000 μl吸头）。

▲关键步骤：务必使用无菌剪刀剪取尖端。

(ii) 在不损坏类器官的情况下尽可能多地移除培养基，将类器官完全浸没在至少500μl的 4%PFA（湿重/体积）中，并在室温下培养30分钟。轻轻除去PFA，换上1ml 1×PBS。在室温下静置 5 分钟，再重复两次 1×PBS冲洗。

注意：PFA 应根据研究所的指导原则进行处理。

(iii) 取下最后1×PBS冲洗液，换上500μl 30%蔗糖（重量/体积），在 4°C下孵育过夜，直至LQG 浸没到试管底部。

▲关键步骤：当放入蔗糖中时，确保类器官漂浮在表面。如果在 4°C下培养过夜后，类器官仍漂浮在水面上，则尝试用200μl的吸头将类器官向下推，看其是否开始下沉。如果在试管中加入蔗糖后，类器官立即下沉或过夜培养后仍未下沉，则终止实验。

(iv) 第二天，将类器官转移到低温模具中，用吸管吸去所有蔗糖。

(v) 将类器官置于低温模底部呈三角形，然后将Tissue-Tek O.C.T. 加入模具中，并完全覆盖类器官。

▲关键步骤：添加的类器官不要超过三个，否则难以切片和收集完整的样本。确保类器官之间有一定的空间，并远离模具壁。

(vi) 将嵌入的类器官直接置于干冰中，直至O.C.T. 完全变白。

暂停点：可将这些模具在-80 °C下保存 1 年以上，直至准备切片。

(vii) 将类器官块转移到低温恒温器中，待其平衡至-20 ℃的室温 15 分钟后进行切片。

(viii) 将类器官在14-20μm处切片并将其收集到载玻片上。

(ix) 使用标准的IHC技术对类器官染色。使用的抗体如表2所示。作为对照，省略一抗或二抗，以确定染色过程中可能产生的自发荧光。

选项 B

将类器官解离成单细胞

时间 2-3 小时

关键：必须注意的是，3个月以上的类器官对单细胞木瓜蛋白酶解离更为敏感。特别是，浦肯野细胞往往过于敏感，无法在解离过程中存活。因此，在进行单细胞分辨率的RNA测序时，建议解离类器官，以获得单个细胞核，而不是整个细胞。

(i) 将旋转瓶或10cm培养皿中的一个类器官转移到60mm细胞培养皿中，培养皿中装有5ml预热至37℃的Worthington木瓜蛋白酶溶液和500μl来自木瓜蛋白酶解离试剂盒的Worthington DNase 溶液。

(ii) 用刀片将类器官切成小块。

(iii) 将装有组织的60mm培养皿放在细胞培养箱中的轨道摇床上，将切碎的类器官放在摇床上以70 rpm的速度在37°C下培养30分钟。

(iv) 用1ml移液管吸头轻轻搅动数次，使碎块破碎。

(v) 在37°C下再培养 5-10 分钟。

(vi) 用10ml血清移液管滴注三酸盐~10次。让滴定后剩余的未分离组织沉淀到试管底部。

(vii) 将细胞悬浮液转移到15ml锥形管中，静置 1-3 分钟，让碎片和未分离组织沉淀到管底。

(viii) 将细胞悬浮液（不含沉淀碎片）转移到一个新的15ml锥形管中，管中已含有5ml厄尔培养基+ 3ml抑制剂溶液。

(ix) 300g 离心7分钟，使细胞沉淀。

(x) 除去上清液，用 500μl至1ml的0.04% BSA/1×PBS重悬细胞。

(xi) 用0.22μm滤篮过滤细胞。

(xii) 台盼蓝计数细胞（见步骤 6）。

(xiii) 重悬细胞至目标浓度1,000 cells/μl。

(xiv) 将细胞置于冰上，等待进一步实验。作为细胞存活率的阴性对照，将一些细胞放在冰上，以确定细胞在进行单细胞测序时的存活率。如果在冰上放置 1 小时后观察到细胞存活率大于 90%，则说明细胞非常健康，并已正确解离。最好尽快对细胞进行处理。

选项 C

对整个类器官进行钙成像

时间 7-10 d

(i) 在24孔低附着平板的一个孔中放入三个类器官，并加入150μl的CerDM3培养基。

▲关键步骤：在孔中加入足够的培养基以覆盖类器官，不能向类器官中加入过量培养基，否则会影响病毒转染的成功率。

(ii) 倾斜板加入1.5μl pAAV-CAG-SomaGCaMP6f2，使类器官沉在孔底，然后将体积直接释放到类器官上，不要用移液器吸头接触类器官。您可以选择加入AAV-null作为感染的阴性对照。

(iii) （可选）如果钙成像实验与光遗传刺激同时进行，则在SomaGCaMP6f2感染后立即加入1.5μl L7-eOPN3慢病毒。您可以选择添加AAV-null作为感染的阴性对照。

(iv) 小心旋转培养皿，防止类器官相互接触，避免类器官融合。将培养皿放入培养箱中静置。

(v) 24 小时后，用500μl与病毒感染所用相同的CerDM4培养基全面更换培养基。

(vi) 病毒转染48小时后，用BrainPhys培养基更换一半培养基。

(vii) 病毒转染72小时后，将类器官转移到装有2ml BrainPhys 培养基的6孔低附着板中。每2天用BrainPhys培养基更换一半培养基。

(viii) 病毒转染5 d 后，常规检查SomaGCaMP6f2是否出现绿色荧光蛋白（GFP）。一旦检测到GFP信号，即进入下一步。

 ◆ 故障排除

(ix) 选择出现强烈细胞特异性荧光信号的类器官，为钙成像做准备。在玻璃底微孔培养皿中加入5μl Culturex，并迅速将类器官置于50μl培养液中。静置培养箱中。

(x) 30 分钟后，加入2ml BrainPhys优化培养基，并将类器官置于双光子显微镜下观察。

▲关键步骤：使用泡沫塑料箱转移类器官时尽量减少移动，以防室温波动。

(xi) 对类器官进行延时记录，捕捉一个成像平面（有关显微镜设置，请参阅 “设备设置”）。

•可以对L7-eOPN3进行光遗传刺激。使用525 nm LED激光以最大强度刺激500 ms。刺激后，按步骤9的方法延时记录钙离子反应。

•可以在培养皿中添加药物来调节类器官的活性。具体来说，可以添加AMPA拮抗剂 NBQX、NMDA拮抗剂D-AP5、GABA拮抗剂Picrotoxin、NMDA激动剂NMDA和Na+通道阻滞剂TT。

▲关键步骤：注意激光会产生热量，要密切监控平台温度，确保不超过37.5°C。

▲注意：在进行药物处理时，请暂停记录以避免眼睛接触激光，并戴上手套小心地在培养基中添加相关药物，并将用过的移液管扔到去污漂白剂中。请务必遵守研究所指南中有关药物处理的具体规定。等待60秒让药物扩散，然后重新开始记录。

(xii) 将显微镜图像导出为 .TIF 文件。

(xiii) 使用 MATLAB 分析软件量化尖峰和爆发的数量并查看光栅图。考虑排除显示非生物相关波形记录的孔，如荧光饱和区域或构成性沉默区域。在 “预期结果 ”部分显示了具有代表性的神经元钙波形，其快速尖峰/峰值高于荧光基线。根据分析参数的不同，可采用单因子或双因子方差分析法分析数据。

选项 D

整个类器官的膜片钳记录

时间 7-10 d

(i) 用AAV8.L7-6.eGFP.WPRE.hBG进行病毒感染，标记浦肯野神经元。

(ii) 准备用于膜片钳记录的类器官，选择那些表现出强大的细胞特异性荧光信号的类器官。

(iii) 将单个类器官移入膜片钳记录室，让类器官沉入记录室底部。

(iv) 将明视野聚焦在类器官边缘，用绿色通道选择要贴片的细胞。

(v) 在贴片吸管和细胞膜之间形成密封。磨合后进行电流钳记录。

 ◆ 故障排除

(vi) （可选）在记录室中添加药物，以便在记录时调节类器官的活动。

▲注意：暂停记录以避免出现噪声信号，并戴上手套小心地在培养基中加入所需的药物，将用过的移液管倒入去污漂白剂中。请务必遵守研究所指南中有关药物处理的具体规定。等待60秒让药物扩散，然后重新开始记录。

材料及设备见原文

参考文献

Atamian A, Birtele M, Hosseini N, Quadrato G. Generation and long-term culture of human cerebellar organoids from pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2024 Dec 2. doi: 10.1038/s41596-024-01093-w. Epub ahead of print. PMID: 39623220.

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来源：培养盒守护者