神户大学提出酵母中强诱导型合成启动子设计原则，优化基因表达调控，成功合成抗体药物

摘要：DNA 是生命的蓝图，控制着细胞要生产什么。DNA 还包含开关，告诉这些细胞何时生产某种东西以及生产多少。因此，在将新基因引入细胞以生产有用的化学物质时，还需要包括一个基因开关，即一段称为“启动子”的 DNA。

DNA 是生命的蓝图，控制着细胞要生产什么。DNA 还包含开关，告诉这些细胞何时生产某种东西以及生产多少。因此，在将新基因引入细胞以生产有用的化学物质时，还需要包括一个基因开关，即一段称为“启动子”的 DNA。

在合成生物学领域中，诱导型启动子常具有不可替代的重要性，其能够精确控制基因表达。然而，由于真核生物启动子的机制复杂程度较高，因此与原核启动子相比，设计真核启动子通常更具挑战性。

酵母的诱导型合成启动子（iSynP）经常会出现泄露问题，一是由于上游随机启动子的转录通读，二是内源性转录激活因子从 iSynP 上游 1 kbp 处的序列对 iSynP 进行长距离激活。如果没有适当的隔离，从头设计的 iSynP 可能会因其中一个或两个事件而发生严重泄漏。目前，iSynP 的最佳设计仍不清楚，即使采用新开发的模型驱动优化技术，设计的启动子在诱导能力方面也很少胜过基准启动子。

近日，来自日本神户大学的 Jun Ishii 团队在 Nature Communications 发表了一篇题为“Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts”的研究论文。他们提出了酵母启动子的 3 个设计原则：插入 > 1 kbp 的绝缘子序列以防止上游隐秘激活序列的转录激活；直接融合 TATA 盒上游的操纵子；增加操纵子重复和/或筛选（突变）细菌操纵子以降低其隐秘激活而不损害与合成转录激活因子 (sTA)的结合，为有效控制微生物生产提供了灵活的指导方针。

图｜酵母中高性能诱导合成启动子的设计策略

为了设计出适用于酵母的强 iSynP 且泄漏最小，研究人员构建了 DAPG-iSynP 作为甲基营养酵母 Komagataella phaffii 的模型启动子，结果发现该模型在无诱导剂时表达量较高。由此研究人员推测远端转录激活是造成泄露的主要原因。因此，他们尝试通过插入长绝缘序列来减少渗漏情况。例如，通过在 iSynP 上游插入不同长度的 K.phaffii DNA 片段，当插入片段最长达到 1.6 kb 时，以长度依赖性方式显著降低了泄漏高达 376 倍，但诱导活性仅略微降低（

随后，研究人员决定构建强诱导型 iSynP，并通过一系列策略对 iSynP 架构进行优化。通过仔细调整 phlO 与 TATA 盒以及起始密码子之间的间隔长度后，研究人员发现特定的间隔长度能够有效提高诱导倍数。比如在 K. phaffii 中构建的 94bp iSynP，其中包含 53bp 的 KpAOX1 核心启动子，在 DAPG 存在的情况下，其诱导倍数高达 1731±60 倍，明显强于常规的 KpGAPDH 启动子，而且该方法具有普适性，在酿酒酵母中，研究人员同样成功利用该方法构建了有效的酵母 iSynP。

图｜新构建的诱导型 iSynP 结构示意图

随后，研究人员采用不同的合成转录激活因子（sTA）和相应的细菌操作子构建了多种诱导型启动子。他们发现增加操作子重复数不仅可以提高诱导倍数，还能降低泄露性。以 KpDAPG-ON 开关为例，当添加 DAPG 时，2 个或更多 phlO 重复与 TATA 盒融合，GFP表达的诱导倍数能够达到>2000倍，且泄露情况可忽略不计；KpTet-ON 开关在 3 个或更多 tetO₂ 重复序列与 TATA-box 融合时，表现出>1000 倍的 GFP 表达诱导。

为了验证这种新构建的强诱导型 iSynPs 的应用潜力，KpDAPG-ON 系统被用于生产各种药物蛋白，包括纳米抗体® ALX-0171（gontivimab），一种治疗呼吸道合胞病毒感染的有效药物；纳米抗体® ALX-0081（也称为 caplacizumab 或 Cablivi®），用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜。

研究人员不仅可以在不同的酵母菌株中生产这两种药用蛋白，还可以在同一菌株中生产，并且能够随时独立控制生产哪种生物制剂。